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规模猪场猪伪狂犬病净化实施效果探究
吴丽艳 1，肖博仁 2 *，韩金凤 1，王勤华 1，杨天宁 2，熊喜华 2（1.佳和农牧股份有限公司，湖南 长沙 410132；2.海博莱生物科技咨询（北京）有限公司，北京 100190）
猪伪狂犬病（Aujeszky's disease，AD；Pseudorabies，PR）是由猪伪狂犬病病毒（AD virus，ADV；PR virus，PRV）引起的猪的急性传染病，病猪、带毒猪以及带毒鼠类为该病的重要传染源，猪只感染后终身带毒，在应激因素的影响下，阳性猪只能排毒，传染其他猪只。该病主要引起种猪的繁殖障碍以及仔猪死亡率增高，育肥猪生长缓慢，给生产带来很大影响。近年来通过gE基因缺失疫苗的使用，配合鉴别诊断、淘汰阳性猪只等综合性措施，越来越多的国家成功地根除了该病并持续保持无疫状态。为贯彻落实国务院发布的《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》对疾病净化的相关要求，防止动物疫病传播扩散，保障动物产品质量安全，国内各规模猪场逐步开展了猪伪狂犬病净化工作。
猪伪狂犬病防控与净化的难点包括且不限于阳性稳定场切断感染循环、母源抗体的干扰，免疫程序制订、引种风险、应激影响以及不正确的免疫操作等。在猪伪狂犬病病毒的清除计划中，最常用的方法有三种，即检测淘汰、后代隔离饲养以及清群/建群，三种方法各有利弊，单纯地依靠一种方法来完成猪伪狂犬病净化目前在我国很难实现。规范的饲养管理，严格的生物安全，以及有效的疫苗免疫防控措施，配合猪场正常的母猪淘汰，通过陆续猪伪狂犬病引入野毒阴性的后备猪来逐步淘汰阳性种猪群，始终保持阴性猪群不转阳，并且阻断育肥猪再次感染，切断猪伪狂犬病病毒在猪场内的循环，是现阶段最适合我国大多数猪场进行净化的一种方法。
本研究在猪伪狂犬病gE抗体为阴性的猪场，通过完善免疫程序，改善gB抗体和中和抗体水平。为了全面、系统、科学评估各阶段猪群猪伪狂犬病真实抗体水平，本研究中不仅使用了常规的ELISA和荧光PCR检测gB、gE抗体以及猪伪狂犬病病原以外，还采用了中和抗体检测作为重点观测指标做对比分析，以期有效指导制定合理的免疫程序，有效防控猪伪狂犬病病毒。
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材料与方法
1.1 试验动物
湖南某规模化养殖场，基础母猪1 500头，将其生产母猪、仔猪及生长育肥猪作为研究对象。
1.2 试验材料
（1）猪伪狂犬病毒Bartha K61毒株活疫苗、灭活苗，由试验猪场购自西班牙海博莱公司，活疫苗、灭活疫苗肌注均为2 mL/头份，喷鼻活疫苗1 mL/头份。
（2）猪伪狂犬病gB、gE抗体试剂盒购自美国IDEXX公司，按照试剂盒说明书进行操作检测。
（3）由湖南农大提供猪猪伪狂犬病病毒变异毒株毒种进行中和抗体检测，滴度为107.7 TCID50/mL。
（4）一次性注射器，一次性使用静脉采血针，普通采血管，棉签，1.5 mL EP管，生理盐水等。
1.3 猪伪狂犬病控制与净化的实施思路与具体措施1.3.1 实施思路
猪伪狂犬病净化方案由6个不同阶段组成，即：调查阶段、强化免疫控制、检疫淘汰、全部或部分清群、监测认证阶段和维持阶段。
净化前调查和评估：按照种母猪群数量的10%采血，分离血清，用gE-ELISA检测，根据野毒抗体阳性率高低，确定种猪群猪伪狂犬病野毒感染状态。1）如果所抽检样品全部为gE抗体阴性，则种猪群全群逐头检测，如所有血清样品均为阴性，可确认种猪群为猪伪狂犬病野毒抗体阴性，直接进入“监测与认证”阶段；2）如果血清样品的gE抗体阳性率低于10%，可进入“检测淘汰”—“监测与认证维持” 的净化方案；3）如果gE抗体阳性率大于10%，可实行“强化免疫控制”—“检测淘汰”—“监测与认证维持”的净化方案。
1.3.2 具体措施
（1）试验猪场按表1对各阶段猪只进行猪伪狂犬病免疫。
（2）试验猪场按表2要求及方法对不同阶段猪只采血，检测猪伪狂犬病gE抗体、gB抗体、猪伪狂犬病病原以及中和抗体。
（3）摸底检测了解猪场猪伪狂犬病感染与免疫现状，对现有的免疫程序进行评估。
（4）根据摸底情况，选择若干批次猪只进行猪伪狂犬病免疫程序的调整试验。设置预产期08.01批次新生仔猪为取消喷鼻的试验组，全批次仔猪取消1日龄的猪伪狂犬病喷鼻操作，其他免疫程序不变，于4周龄采血送检猪伪狂犬病中和抗体，且分别于8周龄、9周龄、10周龄以及11周龄采血送检猪伪狂犬病gE&gB抗体，详见表3；设置09.04日15周龄猪只为伪狂苗活+灭免疫的试验组，全批次猪只在15周龄加免一次猪伪狂犬病活疫苗，22周龄进行猪伪狂犬病灭活苗免疫，分别于20周龄、24周龄、26周龄、32周龄以及36周龄采血检测猪伪狂犬病gE、gB抗体以及猪伪狂犬病中和抗体检测，详见表4。
（5）试验猪调整后的免疫效果符合预期时，全场调整免疫程序并对猪只抗体水平进行评估：试验猪场从2023年4月开始调整免疫程序，即取消喷鼻，育肥猪于10周、15周分别肌注一次活疫苗；后备母猪22周、28周分别肌注一次灭活疫苗，调整后的免疫程序详见表5；对调整免疫程序后的24周龄育肥猪及32周龄后备母猪进行猪伪狂犬病中和抗体检测。
（6）生物安全建设：全程按照管理制度进行，严格按照消毒程序对车辆、人员、物资、饲料和水源进行消毒；定期开展灭鼠和灭蚊虫工作，防止老鼠和蚊虫机械性传播疾病；对围墙进行修补和定期检查，保证场内封闭式生产。
1.4 统计学分析方法
试验数据使用Excel软件进行数据录入、整理和初步分析，用SPSS统计分析软件处理后进行方差分析。P<0.05表示有显著差异。
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结果
2.1 全场摸底检测结果
由表6、图1以及图2可得，采样样品猪伪狂犬病病原检测均为阴性，猪伪狂犬病gE抗体均为阴性；生产母猪及后备母猪猪伪狂犬病gB抗体均为100%阳性；生长育肥猪（6、10、14、22周龄）猪伪狂犬病gB抗体阳性率达不到100%。后备母猪的中和抗体水平较低，平均中和抗体效价仅为1：7。
图1 全场猪伪狂犬病gB抗体阳性率
图2 后备母猪中和抗体效价
2.2 取消喷鼻组猪伪狂犬病抗体水平
由图3可得，取消喷鼻后，仔猪在4周龄时中和抗体效价仍保持较高水平，平均中和抗体效价约为1：162，高于1：128；由图4可知，8、9、10、11周龄的猪只血清gB抗体均为100%，且对比后发现相比免疫前的平均抗体效价1：2，中和抗体效价在10周龄免疫后有显著提高（P=0.012），平均中和抗体效价约为1：6，见图5。
图3 4周龄猪猪伪狂犬病中和抗体效价
图4 8—11周龄猪猪伪狂犬病gB抗体阳性率
图5 10周龄免疫前后猪伪狂犬病中和抗体效价
2.3 活+灭组猪伪狂犬病抗体水平
由图6和7可得，试验组20、26周龄猪只血清gB抗体分别为85%和100%，中和抗体效价26周较20周有显著提高（P=0.018），平均中和抗体效价从1：2提高到1：20，且直至36周龄，猪伪狂犬病中和抗体水平依然保持较高水平，平均中和抗体效价为1：96。试验组32周龄猪只与24周龄猪只在中和抗体效价上呈显著差异（P<0.05），平均中和抗体效价从1：2提高到1：72；试验组36周龄猪只与32周龄猪只在中和抗体效价上呈显著差异（P<0.05），平均中和抗体效价从1：72提高到1：96，见图8。
图6 生长猪猪伪狂犬gB抗体阳性率
图7 生长猪伪狂犬中和抗体效价
图8 不同处理组猪伪狂犬病中和抗体效价
2.4 全场免疫程序调整后猪伪狂犬病抗体水平
由图9、10可得，全场免疫程序调整后24周龄育肥猪gB抗体阳性率为100%，且32周后备母猪的猪伪狂犬病中和抗体效价较高，平均中和抗体效价为1：35，与全场摸底检测时后备母猪猪伪狂犬病中和抗体效价对比，呈显著性差异（P=0.023）。
图9 24周龄育肥猪猪伪狂犬病gE& gB抗体阳性率
图10 全场免疫程序调整后的后备母猪猪伪狂犬病中和抗体效价
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分析讨论
赖志等人的研究关于猪伪狂犬病疫苗的选择原则提到，近年来，猪伪狂犬病病毒出现新的流行变异毒株；王继春、何启盖、严伟东等人也相继对变异毒株展开了研究报道，并将Bartha K61株活疫苗对猪伪狂犬病变异毒株和传统毒株的免疫保护效力进行了分析对比，结果表明Bartha K61株对变异株具有临床保护能力。因此虽然本研究中选择的是Bartha K61株疫苗，但可以针对目前变异株的防控，增加接种次数以提供更加坚强更持久的保护。为制定合理的免疫程序，充分体现抗体产生的一般规律，需要对检测方法进行筛选。中和抗体是针对完整的病毒（gB+gD）抗原决定簇，中和试验作为检测猪伪狂犬病中和抗体的经典方法，其特异性强、灵敏度和可靠性都很高。
试验猪场摸底检测结果表明，该场为猪伪狂犬病病原阴性场，且按原有的的免疫程序进行猪伪狂犬病疫苗接种后，虽然猪场经产母猪gB抗体水平较好，但生长育肥猪gB抗体阳性率达不到100%，后备母猪中和抗体水平也不高。
鼻腔内免疫是一种粘膜免疫方式，可以有效减少猪伪狂犬病病毒对仔猪的感染，王晓阳等人的研究也表明，在猪伪狂犬病高阳性猪场中喷鼻免疫能有效阻断早期的野毒感染，减少仔猪野毒阳性率，显示出良好的保护效果。但在本研究中考虑到试验场为猪伪狂犬病阴性场，感染压力不大，且经产母猪有不错的抗体水平，因此尝试取消仔猪1日龄喷鼻，检测结果表明，取消喷鼻后，4周龄猪只的中和抗体保持较高水平，且10周龄免疫后的猪伪狂犬病中和抗体明显提高，该结果与预期相符，表明在猪伪狂犬病病原阴性场，且感染压力不大的情况下，可尝试将喷鼻接种调整为肌肉注射，在不增加成本的条件下，让仔猪获得更高的抗体水平。
李尚华等人的研究表明，50日龄疫苗免疫时多数仍受母源抗体的干扰，抗体水平呈持续下降趋势。而当70日龄首免时，除个别窝抗体水平仍然下降外，其余均有所上升，因此首免日龄选择在10周龄进行。为进一步提高生长育肥猪的免疫抗体水平，增强免疫保护力，对15周龄生长猪进行加免一针猪伪狂犬病活苗，于22周龄免疫猪伪狂犬病灭活苗，并跟踪生长育肥猪的猪伪狂犬病抗体水平，检测结果表明，活+灭的免疫程序能让仔猪在育肥中后期或后备母猪的抗体水平更高。该结果与吴志金等人的研究结果相符，再一次验证了在猪伪狂犬病病活苗免疫的基础上，加1针灭活苗，能显著提高猪只的中和抗体水平，其效果要比加免活苗的效果好，而且增加灭活苗免疫的次数可以增强这种效果。
全场调整免疫程序后的抗体检测结果表明，生长育肥猪与后备母猪均能保持较高的猪伪狂犬病抗体水平，与试验前的摸底检测结果呈显著差异，该结果再一次验证了喷鼻与活+灭的免疫效果，符合预期；不仅如此，调整后的免疫程序，并未增加疫苗使用成本，因此，经济效益更好，因此对于猪伪狂犬病阴性场来说是该方案是一个高效、经济的免疫方案，是比较理想的免疫程序。
综上，针对猪伪狂犬病阴性猪场，可通过取消仔猪1日龄喷鼻接种以及生长育肥猪使用活+灭的免疫方案帮助猪场提升猪伪狂犬病中和抗体水平，增强免疫保护力，推进猪场的猪伪狂犬病免疫净化进程。
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结论
本研究以湖南某规模猪场生产母猪及生长育肥猪为研究对象，通过对全场摸底检测、完善免疫程序，建立了一个针对阴性猪场的更高效、经济的免疫方案，即取消仔猪1日龄喷鼻，生长育肥猪活+灭（10周、15周免疫伪狂活苗，22周、28周免疫伪狂灭活苗），该方案取得了更好的实施效果，具有推广意义，此实例为其他规模猪场开展猪伪狂犬病的控制与净化提供了参考依据。
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