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高闪电 独军政 周建华 常惠芸**
（中国农业科学院兰州兽医研究所 国家口蹄疫参考实验室
家畜疫病病原生物学国家重点实验室
农业部畜禽病毒学重点开放实验室，甘肃 兰州 730046）
摘要：口蹄疫病毒感染宿主细胞的第一步是病毒与被感染细胞表面的某种受体结合, 在这种受体的介导下，病毒颗粒才能进入细胞内。细胞受体是决定口蹄疫病毒宿主特异性和组织特异性的主要因素之一。口蹄疫病毒受体的研究对于揭示口蹄疫病毒的致病免疫机理具有重要价值。本文就近年来已发现的αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8四种整联蛋白和硫酸乙酰肝素受体作一综述。
关键词：口蹄疫病毒（FMDV） 受体 整联蛋白 硫酸乙酰肝素
口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease, FMD）是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触传染性动物疫病，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类动物传染病之首。FMDV是微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、口疮病毒属(Aphthovirus) 的代表性成员，有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3以及Asia1型等7个血清型。病毒粒子呈球形，不含囊膜，直径23nm左右，由长约8500个碱基的单股正链RNA和衣壳蛋白构成。FMDV衣壳由VP1、VP2、VP3和VP4 4种结构蛋白各60分子组成，呈五、三、二轴对称的正二十面体立体结构。口蹄疫病毒粒子表面明显的特征是VP1的一个环（G-H环）突出于表面，其跨度大约是VP1的140～160位的20个氨基酸残基，该环含有一个高度保守的Arg-Gly-Asp (RGD)基序，参与细胞受体的识别和抗体结合，是FMDV受体的共同识别序列。近年来的研究表明至少有五种细胞识别机制，即细胞表面的整联蛋白αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8和硫酸乙酰肝素可作为FMDV的受体，FMDV通过不同的受体识别并感染细胞，进入其生命循环。
1．FMDV的受体结合位点
FMDV没有像其他小RNA病毒那样明显的表面“谷”(canyon)或“沟”(pit)结构。早期研究证实了VP1上的可移动的暴露区的重要生物学作用：所有FMDV VP1 G-H环及C端是高度暴露区，是FMDV抗原性及结合受体的主要部位。VP1的C端顺时针横贯原体，并与G-H环毗邻，从而形成了与“峡谷”类似的结构。与γ-晶体蛋白中的RGD相同，FMDV G-H环上的RGD基序占据了α 螺旋前的一个转角，形成延伸的构象，并可与整联蛋白结合[1]。 Fox等发现FMDV G-H环上的RGD基序在病毒与细胞吸附中发挥着重要作用，是病毒受体的结合位点[2]。用含有RGD的肽可抑制FMDV的感染力，当FMDV缺失RGD序列或RGD基序发生突变后，会丧失与细胞结合的能力。进一步研究发现，RGD基序的残基，包括RGD+1位和＋4位，对于受体的识别是非常重要的，因为与FMDV C-S8c1株含有RGD的G-H环相似的合成肽可抑制同型FMDV感染BHK(Baby Hamster Kidney)细胞，而当合成肽RGD+1位和＋4位氨基酸发生替代时，这种抑制能力就大大降低了。
除RGD基序外，又发现一些FMDV可利用其它基序与受体结合，如 Martinez 等发现FMDV的RGD变为REG后，仍能在细胞中正常复制，他们推测FMDV可能是采用了另外一种机制来与细胞相识别的[3]。Zhao等用FMDV A12感染性克隆与O/CHA/90及其细胞适应株 vac-O/CHA/90的cDNA构建嵌合病毒，当RGD变为KGE后，不利用硫酸乙酰肝素（HS）仍可在培养细胞中生长，此基序可能是硫酸乙酰肝素和整联蛋白以外其它受体分子的结合位
点[4]。另外，一些FMDV田间分离株(如FMDV-A10, Argentina/61; Gen-Bank accession number V01130)在VP1 G-H环具有SGD基序而非RGD基序，同时Rieder等也发现口蹄疫病毒A24 Cruzeiro 株在牛舌皮接种连续传代时，其RGD基序会变为SGD，这些含SGD基序的病毒只能以αvβ6整联蛋白为受体；而恢复突变的含有RGD基序的病毒，可高效地利用αvβ1和αvβ3整联蛋白受体。这说明FMDV进化过程中会改变与整联蛋白的结合特异性，并且具有与RGD密切相关的其它基序的FMDV，也可通过整联蛋白受体吸附并感染细胞[5]。
2. 整联蛋白受体
整联蛋白是完整的膜受体家族，包括由至少20种不同的α亚基及8种β亚基形成的20 多种α β结合物。整联蛋白受体分子由Ⅰ型跨膜亚基α和β非共价结合组成异二聚体，α和β亚基通常由大的胞外结构域和短的胞浆域以及跨膜区组成。其配体主要有胶原蛋白（Col）、纤维黏连蛋白（Fn） 层黏连蛋白（Lm）、玻连蛋白/外连素（Vn）、血小板凝血酶敏感蛋白（TSP）、胞间粘附分子1（I-CAM1）和C3b等。一些整联蛋白，如 αvβ1、αvβ3、αvβ5、αvβ6、αvβ8、α5β1、α8β1、αⅡbβ3通过结合于RGD基序来识别其配体。整联蛋白对细胞间及细胞与基质的吸附起作用，并且可通过高低亲和力的交替来传导信号进出细胞。许多类型细胞中表达的整联蛋白，通常是以无活性构象存在的，有一种“由里到外”的信号传导（或是整联蛋白激活）可引起配体的变构效应，然后引起整联蛋白配体结合能力的上调[6]。到目前为止，已报道了4种RGD依赖性的FMDV整联蛋白受体，αvβ1、αvβ3、αvβ6、αvβ8，它们介导的病毒吸附过程可被含有RGD的肽抑制，也可被针对整联蛋白的抗体所抑制。
2.1 αvβ3整联蛋白
αvβ3整联蛋白是第一个被报道的FMDV整联蛋白类受体[7]。此整联蛋白在哺乳动物是高度保守的，如牛αvβ3与人αvβ3整联蛋白亚单位的一致性为96％。αvβ3整联蛋白在人主要分布于血管内皮细胞，在FMDV易感动物如牛和猪则分布于多种器官的上皮细胞，如小肠、胆管、肾、子宫内膜，另外在肺和脾的单核细胞中也有表达。αvβ3整联蛋白在介导血管内皮细胞和肿瘤细胞的黏附、淋巴细胞运输、肿瘤生长、骨组织的维持以及感染方面都有重要的作用。除FMDV外，αvβ3还可作为其它病毒的受体或共受体，如柯萨奇病毒A9和埃可病毒1、8、9、22型以及乳头瘤病毒、腺相关病毒2型、汉坦病毒、轮状病毒、人类免疫缺陷病毒也可以αvβ3为受体，人腺病毒以整联蛋白αvβ3和αvβ5为受体，人双埃可病毒（HPEV）以整联蛋白αvβ1和αvβ3为受体。整联蛋白的αv和β3亚基在结构上参与配体的结合，且αv和β3亚基都有自己特异的配体结合域，都可与配体相互作用。FMDV可与提纯的αvβ3整联蛋白结合，且FMDV对LLCMk2细胞的感染可部分被针对整联蛋白αvβ3的单克隆抗血清所抑制。
Neff等报道，K-562和CHO细胞在经整联蛋白αv和β3亚基的cDNA转染后，对FMDV的感染性大大提高。和人源αvβ3相比，牛的αvβ3更为高效，这说明FMDV的物种特异性在一定程度上与它对其自然宿主整联蛋白受体的结合能力有关。进一步研究发现αvβ3整联蛋白是吸附受体，其介导的感染对整联蛋白αv或β3亚基胞内结构域的缺失并不敏感，可能还有另外其他的细胞表面分子作为共受体，在病毒内化过程中发挥作用[8]。牛αvβ3整联蛋白β3亚基胞外结构域的204个C端残基与机体对FMDV的易感性有关，此整联蛋白对RGD基序后面一些不同的氨基酸（包括RGD＋1和＋4位）是有耐受性的，因此它可广泛地结合配体，是多功能的受体。
Xiong 等通过X射线晶体衍射研究了整联蛋白αvβ3胞外部分的晶体结构发现其具有12个不同的结构域（α亚基上4个，β亚基上8个），形成了具有卵形头部及两条尾巴的分子。头部由两个结构域组成， 一个是位于α 亚单位中由7个叶片组成的β片层结构域， 另一个是位于β亚单位中的Ⅰ结构域。尾部是其柔性的关键，与整联蛋白的调控有关。β亚基上的βA结构域具有一个由5个氨基酸组成的依赖金属离子的吸附位点（metal ion-dependent adhesion site，MIDAS），位于具有调节作用的钙离子结合位点附近，Mg2+、Mn2+、 Ca2+均可与MIDAS相互作用导致整联蛋白处于不同的构象状，从而导致其与配体的结合和解离[9]。
2.2 αvβ6整联蛋白
αvβ6整联蛋白只在上皮细胞中表达，而且在不同上皮细胞表达情况各异：舌上皮细胞和唾液腺中有αvβ6整联蛋白表达，但在皮肤和肺上皮细胞很少或无αvβ6整联蛋白表达。αvβ6整联蛋白通常是中低度表达的，但在呼吸道上皮发炎、粘膜及皮肤角化细胞损伤时，其表达会上调。αvβ6整联蛋白是在RGD＋1和＋4位具有亮氨酸残基（RGDLXXL，X代表任意氨基酸）的一小部分配体（如潜态相关性多肽-1(Latency Associated Protein-1，LAP-1)，结合腕蛋白(粘蛋白，tenascin)以及玻连蛋白（Vn））的受体。另外，短肽DLXXL，虽没有完整的RGD，但也是αvβ6整联蛋白的配体。RGDLXXL基序有与LAP-1的RGD具有相似的序列，同样也与FMDV VP1 G-H环中的氨基酸序列相似[10]。因此Jackson等人推测αvβ6是FMDV的受体，他们将整联蛋白β6亚基基因转染FMDV非允许细胞SW480，使其表面表达αvβ6整联蛋白，发现转染细胞对C-S8c1和SAT3 型FMDV（两种病毒都只能利用整联蛋白受体）的感染变得敏感，并且病毒的吸附可被针对的αvβ6整联蛋白的单克隆抗体特异性地抑制，从而证实αvβ6整联蛋白是FMDV的又一细胞受体[11]。
αvβ6整联蛋白是决定FMDV具有上皮细胞嗜性的主要受体，因为在牛自然感染时，αvβ6整联蛋白在出现损伤处的上皮细胞表面是持续性表达的，而αvβ3整联蛋白则检测不到[12] 。αvβ6整联蛋白不仅是吸附受体，而且在病毒与受体结合随后的脱壳、复制等过程中也发挥着重要作用。FMDV可能会激发αvβ6整联蛋白在上皮细胞中的表达，然后FMDV通过依赖网格蛋白（clathrin）的入胞途径来启动感染，αvβ6整联蛋白在此过程中还发挥了将病毒转运到内体的功能[13]。
2.3 αvβ1整联蛋白
αvβ1整联蛋白的表达被细胞特定的形式所限制，虽然一些细胞会大量的表达αv和β1亚基，但不表达αvβ1异二聚体，这给αvβ1整联蛋白受体的研究带来了困难，因此有关αvβ1的报道较少。αv表达缺陷的CHO细胞变异体CHOB2在正常时不能表达合适的整联蛋白来介导FMDV的感染，因此Jackson等将整联蛋白αv亚基的cDNA转染CHOB2细胞使其表面表达αvβ1（人αv/仓鼠β1）功能异二聚体。他们发现转染细胞对FMDV变得易感，用抗αv单克隆抗体或含有RGD序列的肽可以阻断病毒的吸附，从而证实了αvβ1是FMDV的受体，且αv亚基是病毒的主要结合部位[14]。他们进一步发现αvβ1整联蛋白在生理状态的钙和镁离子浓度下是无效的，但用锰离子或是有激活作用的抗β1抗体作用于表达αvβ1的细胞后，FMDV的结合与感染性会显著提高。因此FMDV用αvβ1整联蛋白作为受体的能力可能会依赖于整联蛋白与配体亲和力的细胞调控机制。
2.4 αvβ8整联蛋白
整联蛋白只结合一小部分配体，如转化生长因子β1（TGFβ1）和转化生长因子β3（TGFβ3）中的潜态相关性多肽。最近研究确定了αvβ8整联蛋白是LAP-1的受体，LAP-1的RGD (RGDLATI)与FMDV的RGD (RGDLQVL)比较相似，因此Jackson等推测αvβ8整联蛋白也可能是FMDV的受体，他们将人αvβ8 整联蛋白的cDNA转染到SW480非允许细胞，当此细胞表面表达了αvβ8整联蛋白后，对FMDV的敏感性会明显增加，用针对αvβ8 异二聚体或αv亚基的特异的单克隆抗体封闭后，FMDV不能再结合和感染此细胞[15]。
他们进一步对两种嵌合整联蛋白（αvβ8/6，αvβ6/8）研究发现，β6亚基胞内结构域可有效代替β8亚基胞内结构域，而用β8亚基胞内结构域代替β6亚基胞内结构域时病毒的吸附减弱，不能引起感染。针对αvβ6整联蛋白胞外结构域的抗体不能很好的识别嵌合αvβ6整联蛋白，因此β6亚基胞内结构域对维持αvβ6整联蛋白的正确构象有重要作用，β8亚基胞内结构域的替代不会影响αvβ8整联蛋白的活性。含有RGD的肽GRDGSP对αvβ8整联蛋白的抑制作用明显高于αvβ3整联蛋白。与αvβ6整联蛋白类似，RGD外的其他残基对于维持配体与αvβ8整联蛋白的亲和力，起到了非常重要的作用。在哺乳动物，整联蛋白αvβ8与αvβ6的分布情况相同，都是在上皮细胞，这说明它们有可能在感染的最初阶段发挥着重要的作用。
3. 硫酸乙酰肝素受体
硫酸乙酰肝素（Heparan Sulfate，HS）是L型艾杜糖酸（L-iduronic acid）和D型乙酰葡萄糖胺（D-glucosamin）二糖类的重复二聚体，带负电，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）的碳水化合物成分。硫酸乙酰肝素存在于所有细胞的表面及细胞基质，或是以完整的膜蛋白存在，或是作为细胞外基质的组分[16]。
硫酸乙酰肝素最初被认为是某些O型FMDV株进入细胞的增强子或共受体。随后，发现一些其他血清型(如A型，C型，Asia1，SAT1)的FMDV也可结合硫酸乙酰肝素，并用硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）作为细胞受体。结合了硫酸乙酰肝素的FMDV可在培养的细胞中迅速增殖，形成较小噬斑，毒力增强，宿主范围扩大。当FMDV衣壳外表面只有一个或两个氨基酸残基发生变化，使其所带正电增加时，FMDV结合HS的能力会明显提高，如O型FMDV VP3第56位具有组氨酸残基，在传代时会变为精氨酸，随之形成了高亲和力的硫酸乙酰肝素结合位点。
硫酸乙酰肝素结合位点同时也是O型FMDV 5个抗原位点中的第四个，由原体中央浅的凹陷形成，与推测的心脏病毒的受体结合槽相似。VP3第56位的精氨酸在与硫酸乙酰肝素作用的复合体上占有重要的位置[17]。VP2第135位的精氨酸，在O1BFS和A10是保守的，通过水分子与硫酸乙酰肝素二糖相互作用，起到了辅助作用。对C型FMDV的进一步研究发现，在衣壳的不同位置有残基与硫酸乙酰肝素作用，说明在C型病毒可能不止有一个结合位点。
4. 其他细胞受体
FMDV除了可通过整联蛋白和硫酸乙酰肝素作为病毒受体进入细胞外，又有人提出了第三类受体的假设。如Mason等发现BHK细胞在转染合成的RGD突变的RNA后产生的病毒粒子不具有感染性，与抗体形成复合体后却可感染表达免疫球蛋白Fc片段的CHO细胞[18]，Baxt等也发现FMDV可利用Fc受体来吸附巨噬细胞。这说明病毒还存在其它不是通过RGD—天然受体的感染途径。
Rieder等首次报道了合成的FMDV细胞表面受体。他们将一种与病毒结合的单链抗体(scAb)与细胞粘附分子1 (ICAM1)融合，产生一种新的受体(scAb/ICAM1)。用这种编码scAb/ICAM1 蛋白的DNA 转染对FMDV不易感的细胞，形成的scAb/ICAM1细胞对FMDV易感。缺失RGD 序列的病毒子在动物和其它的细胞上不具有感染性，但能够在scAb/ICAM1细胞上形成斑点[19]。
另外，Baranowski 等也证实在多次传代的FMDV获得了感染人K-562细胞的能力，而人K-562细胞是不能表达αvβ3的。不与HS结合并且缺乏RGD与整联蛋白结合基序的病毒，在BHK-21细胞上能有效地复制。他们指出，作为病毒受体的细胞表面分子对RNA病毒准种提供了一个重要的选择性压力，对FMDV大群体传代细胞培养来选择突变体病毒株，使得不需要高度保守的负责整联蛋白受体的RGD基序[20]。Carmen 等发现适应了BHK-21细胞的FMDV突变株，会扩大其宿主细胞范围，可在其本来不可感染的灵长类和人的细胞系中复制，这也为FMDV新受体的研究提供了新的思路[21]。
5. 展望
FMDV是第一个被发现的动物病毒，一个世纪后的今天，它在结构病毒学中还处于前沿。2001年英国口蹄疫的爆发，使得各国更加重视有巨大经济破坏性的动物疾病。将来更有效的FMD控制有赖于对FMDV的感染及传播的分子机制的研究。随着FMDV结构研究的深入，有关口蹄疫病毒受体的研究取得了很大进步，但是人们对于FMDV与其受体结合的具体过程，以及由此引起病毒的脱壳和机体的感染过程，还知之甚少。一方面口蹄疫病毒对其受体具有亲和特异性，另一方面又可在硫酸乙酰肝素和整联蛋白受体之间相互转换，这是否对FMDV的致病性起了重要作用？硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和整联蛋白的结合位点功能是否独立？FMDV受体的生物学特性又在FMDV持续感染中发挥了怎样的作用？新基序SGD的发现，要求人们从新的角度来研究FMDV与受体的相互作用。另外，目前的研究都是在体外通过细胞培养的方法来研究FMDV与其受体的相互作用的，对于病毒在体内与其受体作用的情况还不太清楚，在体外也未观察到整联蛋白与病毒形成的复合体的结构。因此，（1）在原子的水平上阐明FMDV是怎样识别其特定的受体的；（2）弄清病毒对整联蛋白特异的选择，是怎样决定动物的发病过程以及口蹄疫是怎样在动物群体中传播的；（3）明确整联蛋白在其天然宿主的体内分布情况，以及它们是怎样决定病毒的组织嗜性及其宿主范围的；（4）鉴于口蹄疫对人类健康造成的威胁，因此进一步阐明整联蛋白受体在口蹄疫病毒自然宿主与人体的组成及分布差异，是将来FMDV受体的研究方向，对口蹄疫的防制以及公共卫生都具有重要的理论及应用价值。
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