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猪肠道黏膜中的酶分解产生的优质蛋白源是控制非洲猪瘟病毒传播的一个有效途径。借助稳定的供应链和德克赛尔·巴斯德（Texcell Pasteur）研究所认证的生产流程，能真正保证产品无非洲猪瘟病毒污染吗？
文/ Judit Pou（西班牙Bioiberica公司）
目前，人们对猪副产品生产商可以提供生物安全或预防措施以确保无病毒（如非洲猪瘟病毒）传播表示关注。非洲猪瘟能够造成养猪业的生产和经济巨大的损失。
由于非洲猪瘟病毒在环境中具有较强的抵抗力，因此它可以通过活猪或死猪、家猪或野猪或猪的产品传播，还可以通过受病毒污染的饲料或蜱传播。
非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，有囊膜，病毒颗粒直径约170～193 kb，可编码150多种蛋白质。非洲猪瘟病毒含有多达34种结构蛋白，但p72蛋白是病毒衣壳的主要蛋白质，其分子量约为72000道尔顿，具有极高的免疫原性。非洲猪瘟病毒中的蛋白质分子量从10000道尔顿到150000道尔顿不等。
1 完全可控的生产过程
西班牙Bioiberica公司是一家致力于改善人类、动物和植物健康以及提高人类福利的生命科学企业，核心业务是动物源性生物分子的鉴定、提取和开发，并将它们制造成制药、营养、兽医、饲料和农业等行业所需的高质量产品。
Bioiberica公司是一家纵向一体化的企业，能够确保产品从最初的开发和生产到商业化的整个生命周期都处于公司的管理之中。产品的原材料由公司在欧盟、美国和巴西的8家工厂负责挑选和控制，所有的生产设施都实施共同的质量控制体系和环境友好型生产工艺。
Bioiberica动物营养公司专注于开发、生产和商业化专为提高农场动物、水产动物和宠物生长早期的肠道健康和免疫功能的产品。该公司是一家生产猪肠道黏膜水解蛋白——肝素提取物副产品——的领军企业。用于生产水解蛋白的所有原材料均来自欧盟授权并经当地卫生管理部门认证的屠宰场。
在位于西班牙（一个无非洲猪瘟病毒的国家）帕拉福尔斯（Palafolls）的GMP生产工厂中，提取过程始于猪肠道黏膜的酶消化作用。工厂使用猪肠道黏膜专用收集生产线从适合人类食用的健康动物中收集所需的产品，同时还配备了专用运输设施和车辆，收集的产品直接排放在不锈钢罐中，并且受到PCRs的监控。
由于由国际认证公司负责系统审计，交叉污染的风险得到最大限度的控制。所有这些都提供稳定的供应链模型，并消除了终产品中任何可能存在的病毒DNA。
经过专用的酶水解工艺后，水解蛋白质的分子量小于10000道尔顿（肽）。此外，巴斯德研究所（Texcell）证实，在经过酶消化、分离和过滤后，利用热处理所用的温度和作用时间可以杀灭猪肠道黏膜中任何潜在的病原体。
2 有效杀灭非洲猪瘟病毒
公开发表的文献数据表明，热处理能够非常有效地杀死非洲猪瘟病毒。
Turner和其合作者*评估了热处理对猪粪污中的非洲猪瘟病毒的灭活效果，结果发现非洲猪瘟病毒在53℃和pH 8的环境中5分钟就能被杀死，在65℃下1分钟能被灭活，但是Bioiberica公司能够做到更彻底。
Texcell研究所是巴斯德研究所（Pasteur Institute）的一个分支机构，于2018年11月验证了该热处理工艺，以评估病毒的灭活情况，重点是对非洲猪瘟病毒的灭活情况。
Bioiberica公司采用两个热处理步骤：
在猪肠道黏膜的酶消化期间：100 ℃±5℃持续1小时，85℃±5℃持续30分钟。
在分离和过滤阶段，水解后：90℃±2℃持续3小时。
非洲猪瘟病毒是一种非常特殊的病毒，在病毒验证过程中，参与验证的实验室一般分离不到该病毒。根据欧洲的建议，痘病毒科的牛痘病毒（属于dsDNA病毒，有囊膜）与非洲猪瘟病毒具有共同的特性，因此它是验证非洲猪瘟病毒灭活效果的一个很理想的病毒模型，见表1。
在Texcell研究所的技术报告中，研究人员在最坏条件和衰减条件下研究了两个步骤，以获得病毒的灭活动力学，并考察它的稳定性。
3 酶的消化
100℃±5℃持续1小时
85℃±5℃持续30分钟
检测了4种病毒：伪狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV）、传染性胃肠炎病毒（Transmissible Gastroenteritis virus，TGEV）、脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis Virus，EMCV）和猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV），它们是对理化灭活具有不同抵抗力的猪外来病毒的代表。在最坏条件下，缩减热浓缩步骤，随后的温度参数为：93℃持续1小时，78℃持续30分钟。
对于敏感的有囊膜病毒PRV和TGEV，采用衰减条件灭活：PRV在45℃下持续1小时，然后在30℃下持续30分钟；TGEV在60℃下持续1小时，然后在45℃下持续30分钟。一旦温度达到91℃，这四种病毒完全灭活。衰减系数介于4.63 log**（主要为PRV）和6.34 log**（主要为PPV）之间。
4 分离和过滤阶段：90℃±2℃持续3小时
运用两种类型的原料，如生产的媒介（猪肠道黏膜）和代用品（普通替代媒介），将牛痘病毒、脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV；ssRNA病毒，无囊膜）和犬细小病毒（Canine Parvovirus，CPV；ssDNA病毒，无囊膜）用于验证这一步骤。
牛痘病毒的衰减条件55℃ ±1℃以及CPV和EMCV的衰减条件 65℃±1℃的显示，痘病毒经3小时和脑心肌炎病毒经10分钟的处理后完全灭活。如预期的那样，CPV部分灭活，因为相比牛痘病毒和脑心肌炎病毒的中等抵抗力，CPV具有极高的物理化学抵抗力。
这些实验表明，当受感染的原材料的温度达到87℃时，所有被测病毒均被完全灭活。
根据Texcell研究所的研究，中等抵抗力的有囊膜病毒（如非洲猪瘟病毒）可以享有整体衰减系数超过6 log**，并且这种灭活作用的稳定性已经在温度和处理时间方面得到了充分的验证。
使用最坏条件方法，Texcell研究所证明，BioIberica公司能够利用由最强抵抗力病毒（如PPV）获得的结果推测到非洲猪瘟病毒（非洲猪瘟病毒属于抵抗力稍弱的有囊膜的病毒），导致衰减系数?6.34 log**。
在衰减条件下用更为敏感的病毒如PRV和TGEV获得的结果表明，在温度和处理的持续时间方面都有很大的安全界限。
5 优质水解蛋白的作用
本研究毫无疑问地证明，要防止非洲猪瘟病毒在欧洲的传播，那么在所采取措施中的有潜力的生物安全中断的情况下，应完全消除猪肠道黏膜的潜在传染性。
Bioiberica公司保证，他们的原料不含任何病毒，因为病毒在产品的生产过程中已被灭活清除。将在提取肝素复合物后最终获得的过滤液收集起来并浓缩，以获得高质量的水解蛋白，这些蛋白安全且价格适中，具有很高的生物学价值。
这种水解蛋白产品名为Palbio 50，特点是适口好，香味极佳，具有较高的消化率，其游离氨基酸和生物活性肽的组成非常有价值。所有这些都有助于改善日粮的消化率和动物的采食量，提高动物的生产性能和肠道健康。
* 可提供参考文献。
** 4log或更大值的对数去除率（Log reductions）预示了明显的效果和正在调查的特殊测试病毒。
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