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非洲猪瘟病原学检测方法研究进展
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2020/1/31 13:59:48 关注：889 评论： 我要投稿
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摘要：目前，非洲猪瘟（ASF）尚无有效疫苗可以预防，快速、准确的病原学检测是防控该病的重要技术手段。本文综述了ASF病原学检测方法：免疫荧光、ELISA、免疫层析试纸条等抗原检测方法，其使用方便、快速，目前主要应用于急性发病或病死猪的快速诊断及群体筛查；PCR、荧光定量PCR、环介导等温扩增等分子生物学检测方法仍是ASF病原检测的主要手段，特别是荧光定量PCR方法以其敏感、特异、快速、稳定的优点在我国实践中广泛应用。随着微流控、化学发光、基因芯片等新技术不断应用，各种自动化、一体化、便携式设备不断研发，将会为ASF防控提供有效技术支持。
非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（ASFV）感染引起的家猪和野猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，是我国一类动物疫病，世界动物卫生组织（OIE）法定报告动物疫病。我国自2018年8月确诊首起疫情以来，该病已扩散蔓延至除台湾、澳门外全国所有的其他省（直辖市、自治区），给我国养猪业及相关行业造成了巨大的经济损失，甚至影响到肉品市场供应。
目前，本病尚无有效疫苗可以预防，疫病防控主要依靠实施严格的生物安全措施。实现准确、快速的病原学检测是ASF防控的基础，可为各项防控措施的制定、实施及评估提供有效支持。本文就相关病源学检测方法进行简要综述，以期为我国ASF防控和诊断技术研发提供参考。
病毒分离
采集猪血液、脾脏、淋巴结等组织样本，接种猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAM）等原代细胞。ASFV会在易感细胞中复制并产生细胞病变（cytopathic effect，CPE）。在细胞培养中加入猪红细胞后，多数ASFV毒株会产生红细胞吸附反应（hemadsorption，HAD），即在感染的白细胞周围吸附猪红细胞形成“玫瑰花环”。由于部分ASFV毒株并不产生HAD，若分离培养物中出现CPE而没有出现HAD，则需采用免疫荧光或PCR等方法确认细胞中是否存在ASFV；如果未出现CPE，免疫荧光和PCR检测也为阴性，需传代3~5次，方可确认为阴性。在首次暴发ASF的地区，经PCR、免疫荧光等方法检测为阳性的样品，建议采用HAD方法进行病毒鉴定。
抗原检测
免疫荧光法
免疫荧光法是OIE推荐的ASF检测方法之一。通过异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记抗ASFV特异性抗体，实现脏器涂片或薄层冷冻切片、细胞培养物中的ASFV抗原的检测。免疫荧光法是鉴别不产生HAD的ASFV毒株感染，以及区分ASFV与其它病毒（如伪狂犬病毒）产生CPE的重要手段。免疫荧光法检测对于急性ASF感染高度敏感，但在亚急性和慢性感染中，敏感性显著下降，可能与感染组织中已形成抗原抗体复合物，阻断了ASFV抗原与检测用抗体的结合有关。
ELISA法
Wardley等采用抗ASFV的特异性血清IgG作为包被蛋白，建立了间接ELISA方法，检测ASFV抗原浓度为50~500 HAD50/mL。Vidal等采用抗ASFV VP72蛋白的单克隆抗体，建立了夹心ELISA方法，检测VP72抗原浓度为0.05 μg/mL，全病毒为2.3×102 PFU/mL。Hutchings等研究发现采用抗ASFV的多克隆抗体，比采用抗VP72蛋白单克隆抗体包被蛋白时，检测ASFV抗原稍敏感。
目前，已有商品化ASFV抗原ELISA检测试剂盒出售，与荧光定量PCR方法相比，具有设备要求低、成本低、操作方便等优势，但敏感性和特异性有待提高。基于此，已有学者和公司将化学发光技术应用于ELISA检测结果判定，建立了ASFV化学发光ELISA，其检测敏感性显著提升。与免疫荧光法相似，在亚急性和慢性感染中，抗原ELISA的检测敏感性显著降低。粮农组织（FAO）建议ELISA方法用于“群体”样本大规模筛查，并需辅助以其他检测方法。
免疫层析试纸条法
Sastre等应用抗VP72蛋白单克隆抗体研制免疫层析试纸条。对实验感染猪的ASFV血液样品的检测结果表明，该试纸条可检测病毒含量超过104 HAU的样本；临床样品检测结果显示，PCR方法阳性检出率最高，试纸条阳性检测率（60%）高于商品化的抗原检测ELISA试剂盒（48%）。吴海涛等以抗VP72蛋白单克隆抗体作为金标抗体，以ASFV多克隆抗体作为检测线，制备了胶体金试纸条，针对重组VP72蛋白的最低检出限在20 ng/mL左右。刘波以抗K205蛋白单克隆抗体作为金标抗体，用兔抗K205R蛋白抗体作为检测线，制备的胶体金试纸条针对重组K205R蛋白的最低检出限为30~40 ng/mL。
经过多年发展，目前胶体金免疫层析试纸条仍是最成熟，也是普遍应用于ASF检测的方法，其临场使用简便、快速，但也存在敏感性低的不足。近年，一些免疫学新技术不断涌现，市面已出现基于乳胶凝集、荧光微球技术研发的非洲猪瘟病原检测用免疫层析试纸条，新方法的运用显著提升了检测敏感性，具有良好应用前景。
分子生物学检测方法
与免疫学检测技术相比，分子生物学方法通常更加敏感、特异，且同样适宜于高通量检测。OIE在《陆生动物诊断实验和疫苗手册》中推荐了PCR检测法，并常作为ASFV检测的“金标准”。此外，国内外学者还进行了线性指数PCR、数字PCR、重组酶聚合酶扩增等方法的探索。
常规PCR检测法
基于凝胶电泳的常规PCR检测方法，其ASFV最低检出限多为几十到上百拷贝的DNA。Agüero等基于VP72基因设计建立了常规PCR检测方法，可以检测到0.12 HAU50的ASFV且具有良好的特异性，是目前OIE推荐的PCR检测方法。罗玉子等建立了改良的常规PCR方法，其最低检出限可达到60拷贝，比OIE推荐PCR方法更加敏感。崔尚金等建立了新型纳米PCR检测方法，最低检出限可达10拷贝DNA。
除了单独检测ASFV病原的PCR方法，也有同时检测多种猪病的多重PCR方法的报道。Hu等建立了同时检测鉴别ASFV、猪瘟病毒、高致病性蓝耳病病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒的多重PCR方法，其中ASFV最低检出限为1.50×103拷贝DNA。
荧光定量PCR检测法
与常规PCR相比，荧光定量PCR扩增的基因片段更短，通常更加快速、敏感，最低检出限可达几个到几十拷贝的DNA模板；同时不需开盖，可减少扩增产物污染的可能，是目前生产实践中ASFV检测应用最多的一类方法。
King等依据VP72基因建立了基于Taqman探针的荧光定量PCR方法，最低检出限约为40 拷贝DNA，是目前OIE推荐的检测方法。Mckillen等根据9GL基因设计引物，建立了基于MGB探针和分子信标探针的荧光定量PCR检测方法，最低检出限均达到20 拷贝DNA。Ronish等依据VP72基因建立了基于线性指数的PCR（linear-after-the-exponential PCR，LATE-PCR），最低检出限可达到1~10拷贝DNA。Fernández-Plinero等采用商品化通用探针库中探针，结合VP72基因特异性引物，建立荧光定量PCR方法，同时设置猪β-actin作为内参对照，发现该方法最低检出限为18拷贝DNA。
根据探针标记荧光基团的不同，采用荧光定量PCR方法也可实现多病原的同时检测。Grau等建立了可从猪唾液样品中同时检测ASFV、猪瘟病毒、口蹄疫病毒3种病原的荧光定量PCR方法。
恒温扩增检测法
恒温扩增检测技术是近年分子诊断研究热点，具有两方面突出优势：一是可以使用水浴设备在单一温度下进行等温反应，无需昂贵的热循环设备，且反应时间短；二是可通过在体系中添加的颜料色彩变化或是在试纸条上形成检测线，直接肉眼判别结果，适合现场检测。
Hjertner等最早建立了ASFV侵染检测（invader assay）恒温扩增技术。该技术能够精确地定量DNA和RNA靶基因片段，检测ASFV最低检出限为2 500拷贝DNA，与猪瘟病毒无交叉反应。虽然此技术敏感性低于其他分子检测方法，但能够检测含有大量ASFV的病死猪样品。
James等建立了ASFV环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification method，LAMP），其最低检出限为330拷贝DNA。国内学者江彦增等、王彩霞等、杨吉飞等也建立了LAMP检测方法，最低检测限可达10拷贝DNA。除了通过专用浊度仪生成曲线判定结果之外，LAMP方法可通过在体系中添加钙黄绿素等颜料，扩增后利用颜色变化方便肉眼判读结果。
李林等建立了实时荧光重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）方法。该方法在20 min内即可检测16拷贝DNA，且与猪瘟病毒、猪圆环病毒II型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒均无交叉反应，为我国ASFV临床鉴别诊断、检验检疫和病原监测提供了技术支持。Miao等[26]结合应用试纸条判定RPA检测结果，该方法可在10 min内检测150拷贝ASFV的DNA，且与其他猪病无交叉反应。
Fraczyk等建立了交叉引物扩增方法（cross-priming amplication method，CPA），对VP72基因的标准质粒最低检出限达7.2拷贝，同时可通过在反应体系中添加SYBR Green I染料，阳性扩增产物经紫外光照射产生明亮的绿色荧光，肉眼判定结果。Gao等将CPA技术与试纸条联用，建立了ASFV检测方法，可检测200拷贝DNA，在临床样品的检测中，与荧光定量PCR方法符合率达97.4%（44/45）。
Wozniakowski等利用一种新型的聚合酶交叉螺旋反应（polymerase cross-linking spiral reaction，PCLSR），检测猪血中的ASFV核酸，该方法可检测7.2×102拷贝/μL的VP72质粒模板，与猪瘟病毒、蓝耳病病毒、猪流行性腹泻病毒无交叉反应。
数字PCR法
数字PCR（digital PCR，dPCR）是第三代PCR技术，具有高灵敏度、高精确性、高耐受性、绝对定量等特点。邬旭龙等根据ASFV K205R基因设计1对特异性引物和TaqMan探针，建立了ASFV实时荧光定量PCR和微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）检测方法。经检测，建立的ASFV 荧光定量PCR和ddPCR检测方法线性关系较好（R2≥0.998），ddPCR的最低检出限可达到0.36 拷贝DNA，在20 μL反应体系中约为10拷贝/反应，具有很高的特异性和重复性，且不与其他常见猪病病毒发生交叉反应。
生物传感器法
Biagetti等基于DNA/LNA探针与VP72靶基因保守区互补配对，建立了ASFV生物传感器检测方法。该方法最低检出限为178拷贝/μL基因组DNA，定量限为245拷贝/μL DNA，可一次性检测40份样品，单次测试时间仅需要5 min。在ASFV临床感染样品检测中，与OIE推荐的荧光定量PCR方法具有极好的相关性。
原位杂交法
Ballester等使用原位杂交技术，用地高辛标记的探针检测福尔马林固定、石蜡包埋组织中的ASFV 基因组DNA，并取得较好的检测效果。
小结
目前，根据我国ASF防控政策，ASFV分离、鉴定工作仅能在许可的实验室中开展。胶体金试纸条、ELISA等免疫学病原检测方法，使用方便、快速，但受限于敏感性和特异性，目前主要应用于急性发病或病死猪的快速诊断及群体筛查；分子生物学检测方法仍是ASFV病原检测的主要手段，特别是荧光定量PCR方法以其敏感、特异、快速、稳定的优点在我国实践中广泛应用。
应用ASFV分子生物学检测方法时，应注意如下两方面：（1）分子检测方法是对ASFV基因组DNA进行检测，因此当检测结果为阳性时，仅表示检测样品中存在病毒核酸，并不能说明样品中是否具有感染性的病毒粒子，如火腿、肉肠、血粉等产品检测结果为阳性时，应综合考虑其加工工艺，也就是通过高温煮熟、熏制等是否足以杀灭病毒。（2）应注意分析结果的准确性，在检测过程中适当增加对照及质控样品。分子检测方法灵敏度较高，当样品处理时出现样品间交叉污染，或是由于扩增产物造成环境污染等，易出现假阳性结果；当样品腐败变质，或是在反应体系中存在扩增反应抑制成分时，易造成结果的假阴性。
当前，微流控、化学发光、基因芯片等新技术开始不断应用于动物疫病检测领域，各种自动化、一体化、便携式或高通量设备不断被研发，未来ASFV病原学检测将更加快速、准确及自动化，必会进一步为ASF防控提供有效支持。
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| 文章来源：中国动物检疫 ，作者南文龙 文章编辑：一米优讯 |
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