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摘要：为了解新疆乌鲁木齐市活禽交易市场内禽流感病毒污染状况以及亚型分布情况，掌握活禽档口、活禽屠宰点及活禽运输车辆的禽流感病毒流行规律，对采集的437份棉拭子样本，采用实时荧光定量RT-PCR方法检测禽流感病毒核酸，再对阳性样品进行核酸分型。结果显示：473份样品中，检出禽流感病毒核酸阳性115份，阳性检出率为24.31%，其中H5亚型26份，阳性检出率为22.6%，H9亚型45份，阳性检出率为39.13%，未定型44份，阳性检出率为38.26%，未检出H7亚型；活禽运输车、活禽档口和活禽屠宰点的阳性检出率分别为29.69%、24.15%和21.74%；活禽档口中的污水（44.90%）、笼具（34.69%）、粪便（24.49%），活禽屠宰点的脱毛机（47.80%）、接血槽（34.78%），以及活禽运输车的装载笼具（56.25%）的阳性检出率较高。结果表明：该活禽交易市场禽流感病毒污染状况较为严重，污染范围较广，活禽运输车、活禽档口和活禽屠宰点均有污染；活禽档口中的污水、笼具、粪便，活禽屠宰点的脱毛机、接血槽，以及活禽运输车的装载笼具为禽流感病毒散播的关键风险点。结果提示，需加强市场日常管理及清洗消毒，降低禽源流感病毒通过活禽交易市场传播的风险。本调查为制定科学有效的活禽交易市场日常管理及消毒措施提供了技术支持。
禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）是正黏病毒科的RNA病毒，根据病毒粒子表面抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的不同，分为不同亚型，目前发现有18种HA亚型和11种NA亚型，其中H1—H16、N1—N9各亚型流感病毒均可在禽类中分离到。禽流感对养禽业危害极大，因而被世界动物卫生组织（OIE）列为须通报动物疫病，其中高致病性禽流感被我国列为一类动物疫病。AIV不仅血清型较多，而且毒株容易变异，其中高致病性AIV还具有蔓延速度快、致死率高等特点。AIV也会感染人。研究发现，大多数人感染病例都有活禽接触史或去过活禽交易市场，而且活禽市场环境中有较高的病毒阳性率。目前认为活禽交易、屠宰、加工等涉禽场所是人感染的主要地点。对这些地点进行合理消毒是切断禽流感传播途径的一种有效方法。因此，为了解新疆乌鲁木齐市活禽交易市场AIV污染状况，开展了活禽档口、活禽屠宰点以及活禽运输车辆三大主要环节的AIV核酸检测，以期为降低活禽交易市场禽源流感向外界传播的风险，指导活禽市场清洗消毒提供依据。
材料与方法
材料
样本。每个活禽档口，采集地面、墙面（高于地面约0.8m）、笼具、采食槽、污水及粪便的棉拭子；每辆活禽运输车，采集轮胎、车厢、笼具及驾驶室棉拭子；每个活禽屠宰点，采集脱毛机、接血槽、刀具案板、污水及地面棉拭子。将采集后的样本放在装有冰袋的采样箱内送至实验室。共在该活禽交易市场的49个活禽档口、16辆活禽运输车和23个活禽屠宰点，采集473份棉拭子样本。
方法
样品灭活。将采集的棉拭子样品放入恒温水浴锅中，56℃ 30min灭活。
AIV核酸提取。将水浴锅中的棉拭子样品取出后，置于振荡器充分震荡，然后8000r/min，离心2min；取100mL上清液至1.5mL灭菌离心管中，参照柱式RNA核酸提取试剂盒说明书提取AIV RNA，并将提取后的核酸-20℃保存待检测。
AIV核酸检测。将提取的RNA核酸，参照AIV通用型荧光定量RT-PCR检测剂盒说明书进行检测。
AIV核酸分型。将检测为阳性的核酸，参照H5、H7和H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测试剂盒说明书进行分型，对阴性样品定义为未分型。
结果与分析
AIV核酸检测
基本情况。473份棉拭子样本中，检出AIV核酸阳性115份，阳性检出率为24.31%。其中：活禽屠宰点阳性25份，阳性检出率为21.74%；活禽档口71份，阳性检出率为24.15%；活禽运输车19份，阳性检出率为29.69%。
活禽档口。在6种棉拭子样品中，均有阳性样品被检出，其中污水和笼具样品的阳性检出率较高，分别为44.90%和34.69%，墙面和地面较低，分别为12.24%和10.20%（表1），说明活禽档口AIV污染较广，而污水和笼具是活禽档口最严重的AIV污染源。RT-PCR检测结果见图1。
活禽运输车。在4种棉拭子样品中均检出AIV阳性，其中运输车辆车厢内装活禽的笼具污染最严重，阳性检出率为56.25%，轮胎中的阳性检出率最低，为12.50%（表2），说明活禽运输车辆的AIV污染较严重，其中笼具是运输车辆污染的最重要环节。RT-PCR检测结果见图2。
活禽屠宰点。在5种棉拭子样品中，除地面未检出阳性外，其余4种均检出阳性，其中脱毛机和接血槽阳性检出率较高，分别为47.8%和34.78%（表3），说明活禽屠宰点的屠宰工具或用具最易污染AIV。RT-PCR检测结果见图3。
AIV核酸分型
115份AIV核酸阳性样品，经H5、H7和H9亚型三重荧光定量RT-PCR检测，检出H5亚型26份，阳性检出率为22.6%，H9亚型45份，阳性检出率为39.13%，未定型44份，阳性检出率为38.26%，未检出H7亚型（表4），说明活禽市场H9亚型AIV污染最严重，也存在一定比例的H5亚型病毒污染。H5和H7亚型AIV核酸荧光RT-PCR检测结果分别见图4和图5。
讨论
2014年7月新疆报告首例人H7N9流感病例，加之乌鲁木齐作为新疆地区的首府城市，是最大的活禽集散、交易、流通地，又有3条候鸟迁徙路径途径乌鲁木齐市，因此高致病性禽流感给本地区人民的生命财产安全造成极大威胁。为了便于集中统一监督管理，乌鲁木齐市将原3个活禽交易市场搬迁集中至该活禽市场。从该活禽交易市场3个主要环节来看，活禽运输车（29.7%）、活禽档口（24.15%）、活禽屠宰点（21.74%）都存在AIV污染，而且污染都较为严重。从我国其他省市活禽交易市场的检测结果来看，广东省广州市活禽交易市场AIV核酸群阳性率为49.21%，广东省东莞市阳性率为11.05%，安徽省惠州市阳性率为22.14%，2014—2017年云南省保山市阳性率为2.50%~68.18%。这些均充分说明活禽交易市场散播AIV的风险较高。
活禽档口内的污水、笼具、粪便阳性检出率较高，与闭福银等、薛娜等的相关报道一致，说明这些是活禽市场禽流感防控消毒工作的关键点。活禽档口内的污水污染状况很大程度上跟内部的排水系统有关。据调查，该市场内22个档口的下水道均有不同程度的堵塞，且冲洗笼具、地面等污水未经严格消毒直接排出。因此，应尽快改善交易市场活禽档口内的排水系统，尽可能保障污水能及时排出。由于从事活禽交易职业人群的自我防范意识差，且活禽交易市场人员密集、流动性强，已成为人感染AIV的最危险场所，因此应该加强对活禽交易职业人群的禽流感知识培训，提高其自我防护意识。
活禽运输车装载活禽的笼具阳性检出率高达56.25%，是活禽运输环节的关键消毒点。冬季室外温度较低，活禽排泄物容易结冰，更易导致冲洗消毒不彻底，这可能是笼具阳性检出率较高的主要原因。有4辆车的驾驶室检出阳性，说明驾驶员的流动也会造成病毒传播。调查发现，该活禽交易市场内的活禽大多不是本地饲养而是由外地运输而来的，提示应该做好运输检疫，对进入活禽交易市场内的活禽运输车辆严格把关，要经产地检疫认可、抽样检疫认可、工具消毒认可后，才能三点连一线，开检疫证明，验证放行。要做好入场消毒，这是避免疫病凭借交通运输工具传播蔓延的有效方法。
活禽屠宰点的脱毛机、接血槽阳性检出率较高，是市场活禽屠宰点禽流感防控消毒工作的关键点。调查发现，屠宰点对屠宰工具的消毒并不全面彻底，只把消毒重心放到了地面消毒上。虽然一般情况下AIV跨种传播能力较低，但仍存在感染人的风险，尤其是有交易市场活禽接触史和暴露史的人群。目前认为，活禽屠宰加工点、交易市场等涉禽场所是人感染AIV的高风险地点。
各亚型阳性率比较发现，H9亚型阳性检出率较高（39.13%）。这可能与市场内水禽数量较多而且种类复杂有关。调查显示，该市场每日鸭子、鹅及鹌鹑的交易数量占交易活禽总数的10%。建议该活禽交易市场尽量将交易水禽集中至固定档口，与陆禽分开。该市场也存在一定比例的H5亚型病毒污染（22.6%），提示活禽养殖户应在养殖环节进一步加强H5亚型的防控工作。
此次调查是在冬季开展的，因此只掌握了冬季该活禽交易市场AIV污染状况和分布特点，计划后期在春、夏及秋季持续开展调查，以充分了解活禽交易市场全年的AIV污染分布状况，从而科学有效指导交易市场开展消毒工作。
结论
调查发现，该活禽交易市场AIV污染较为严重，活禽运输车、活禽档口和活禽屠宰点均有污染，其中活禽档口中的污水、笼具、粪便，活禽屠宰点的脱毛机、接血槽，以及活禽运输车的装载笼具为AIV传播的关键风险点，应特别注意加强消毒。
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