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摘要：为了解我国猪肺炎支原体种群结构和进化关系，2018—2019年采集山东、广西、河南、江西、云南、天津、湖南等地猪组织样品1242份，进行猪肺炎支原体荧光定量PCR和巢式PCR检测，并对测序确认的87份阳性样品，采用adk、rpoB、tpiA 3个管家基因作为分型参考进行多位点序列分型（MLST），并对3个管家基因均扩增成功的阳性样品进行p146基因分型，分析我国猪肺炎支原体种群结构，并结合pubmlst数据库公布的151个序列类型（ST）进行eBURST分析。结果显示：有24份阳性样品的3个管家基因全部扩增且测序成功，共分为10个ST，均为国内外首次报道；10个ST分为3个克隆复合体（CC）和4个独特型，其中ST128占41.7%（10/24），样品来自江苏、河南和广西，为本次检测的主要流行型。结果表明，我国猪肺炎支原体分布较广，具有一定的基因型独特性。本研究为我国猪肺炎支原体的流行病学数据库研究提供了新资料，有助于掌握国内猪肺炎支原体基因型分布情况，进一步完善了猪肺炎支原体流行病学数据库。
猪肺炎支原体可引起猪地方流行性肺炎，俗称气喘病。该病广泛分布于世界各地，以咳嗽和气喘为主要临诊症状，不同年龄猪群均易感，表现为长期生长发育不良、饲料转化率低、发病率高，但死亡率较低。猪肺炎支原体还常与多种细菌、病毒及环境因子协同作用，引起猪呼吸道疾病综合征（porcine respiratory disease complex，PRDC），导致严重的临床疾病，造成较大的经济损失，对养猪业带来严重危害。
猪肺炎支原体分离培养过程繁琐、耗时长，虽然是诊断该病的金标准，但并非常规诊断方法。目前，对提取的样品核酸直接进行基因分型已成为该病流行病学调查中的常用方法。关于猪肺炎支原体的分型方法有多种，包括借助毒力基因作为分型依据的方法，如编码黏附素样蛋白的p146基因分型。该基因包含丝氨酸重复序列，可用于数目可变串联重复序列（variable-number tandem repeat，VNTR）分析或序列分析。多位点数目可变串联重复序列分析（multiple-locus variable-number tandem repeat，MLVA）是借助管家基因作为分型依据的方法，如多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）。MLST重复性好，操作简便，易于实验室间比较，已被广泛应用于微生物流行病学检测和进化研究。在猪肺炎支原体流行病学调查中，常常将MLST与VNTR或p146基因分型相结合。本研究对采集自山东、广西、江苏、河南、江西等地区的猪组织样品进行猪肺炎支原体检测以及MLST及p146基因分析，并与数据库中的猪肺炎支原体分离株进行比对，以期为猪肺炎支原体流行和预防提供参考。
材料与方法
试剂与仪器
高通量核酸提取仪、高速台式离心机、荧光定量PCR仪、移液器。
方法
猪肺炎支原体检测。2018—2019年采集山东、广西、河南、江西、云南、天津、湖南等地猪组织样品（淋巴结及肺组织）共计1242份，先用mhp165/183荧光定量方法筛选猪肺炎支原体阳性样品，再用巢式PCR方法检测并测序确认，最终对检出的87份（7.0%）阳性样品进行MLST分型。
MLST及p146基因分型。选择adk、rpoB、tpiA 3个管家基因作为分型参考，对检出的87份阳性样品进行PCR扩增，记录3个管家基因均扩增成功的样品，并将3个管家基因均扩增成功的样品进行p146基因扩增，引物序列见表1。将扩增产物测序，并在数据库（http://pubmlst.org）中找出并沿用与测序基因组相同的等位基因号，在数据库中输入3个管家基因及p146基因的等位基因号，得到对应的序列类型（ST）。
数据分析。采用PHYLOViZ软件BURST算法进行分组和聚类，对数据库中来自15个国家的151个ST，划分为相应的克隆谱系来研究其进化关系；采用MEGA v6.0软件Clustal W算法，进行管家基因及p146基因序列比对；分别用最大似然（maximum likehood）及邻接（neighbor-joining）算法，构建系统发育树，重复抽样1000次。
结果与分析
MLST及p146基因分型
在87份猪支原体肺炎阳性样品中，有24份样品3个管家基因全部扩增且测序成功，扩增成功率（27.6%）高于同时扩增7个管家基因，与Kuhnert等的研究结果一致。等位基因（adk、rpoB、tpiA、p146）及相应的ST见表2。24份样品检测分为10个ST，均为新发现的ST。其中，ST128在本次检测中占41.7%（10/24），样品来自江苏、河南和广西。分别计算两种分型方法的辛普森指数，得出p146为0.947（95%CI：0.898~0.995），MLST为0.823（95%CI：0.695~0.951）。
根据maximum likehood，对管家基因构建系统发育树。结果（图1）显示：大多数样品（23/24）属于A和B两系，大多数ST（8/10）位于A系，包括美国232株、英国J株和中国168株，ST129为B系，ST130、法国BQ14株和巴西7448株处于A和B系之外。对ST相同的菌株进行p146基因neighbor-joining分析，可将ST128、ST129进一步分为两个分支。
eBURST分析
本研究将至少包含2个ST定义为1个CC，其中每个ST至少与组中任意1个ST共享3个等位基因中的2个。151个ST共分为13个CC和49个独特型（singleton），其中CC0包含43个ST，占ST总数的28.5%。本次检测新发现的10个ST共分为3个CC和4个独特型（图2），其中CC4包含ST128、ST146、ST148、ST43（古巴分离株），样品来自江苏、河南和广西，占所有分型样品的54.2%；CC5包含ST145、ST147和ST61（168株），样品来自江西和广西；ST130属于CC0，样品来自山东。
讨论
猪肺炎支原体是一类无细胞壁的微生物，对营养要求非常高。我国1973年首次分离到该病原。目前国内外已建立了多种猪肺炎支原体PCR检测方法，均可针对样品核酸直接检测。本研究选择敏感性较高的荧光定量PCR方法进行初筛，用巢式PCR并测序的方法，对初筛阳性样品进行确认，在山东、广西、河南、江西、江苏、上海、云南、湖南采集的猪组织样品中均检测到阳性样品，样品阳性率为7.0%，提示猪肺炎支原体在我国广泛存在。
鉴于猪肺炎支原体分离培养时间长、分离率低，近年来国外常用对提取的样品核酸直接进行基因分型的方法，进行猪肺炎支原体流行病学调查。由于MLST扩增基因较多（通常为efp、metG、pgiB、recA、adk、rpoB、tpiA 7个管家基因），受样品新鲜度、样品中病原含量等因素影响，国外常用其中3个管家基因（adk、rpoB、tpiA）进行扩增，以提高扩增成功率，且3个管家基因的分型能力与7个管家基因一致。Pubmlst数据库也使用3个管家基因作为ST定型依据。本研究以国外研究为基础，对我国猪肺炎支原体阳性样本进行MLST分析，发现3个管家基因扩增成功率为27.6%，检出10个ST，均为国内外首次报道，这为我国猪肺炎支原体的流行病学数据库研究提供了新资料。
本研究在扩增MLST管家基因的同时，也扩增了p146基因，分别计算辛普森指数，得出p146（0.947，95%CI：0.898~0.995）大于MLST（0.823，95%CI：0.695~0.951），说明管家基因相对保守；以毒力基因p146作为分型依据，可以对ST相同的菌株进一步进行亲缘分析，从而提供更多的进化信息。在本研究中，不同的ST型（样品GX8-2、GXF19）却有着相同的p146基因型（130），提示p146基因可能随机发生了相同的突变事件，仅用p146基因分型可能不足以阐释猪肺炎支原体之间的进化关系，因此p146基因分型可作为MLST的补充用于流行病学调查，这与Felde等的研究一致。
分析显示，ST128占41.7%（10/24），样品来自江苏、河南和广西，是本次检测发现的主要流行型。本研究尝试用3个管家基因，对pubmlst数据库中151个ST进行eBURST分析，发现ST128与ST146、ST148均属于CC4，是本次检测的主要克隆复合体。古巴分离株ST43属于CC4，ST130属于CC0，可能是由位于中心位置的ST48（希腊分离株）进化而来的。该分析与Mayor等对7个管家基因的聚类分析结果相比有部分差异：Mayor等对30个ST（ST1~30）进行最小生成树分析，聚类为4个CC，包括17个ST。这说明扩增管家基因数量的不同可能会导致聚类的差异。本研究有助于掌握国内猪肺炎支原体基因型分布情况，进一步完善猪肺炎支原体流行病学数据库。
结论
研究表明：猪肺炎支原体在我国广泛存在；MLST结合p146基因分型可用于猪肺炎支原体进化关系分析；本次检测发现的10个ST均为国内外首次报道，其中ST128为主要流行型，表明我国猪肺炎支原体基因型具有一定的独特性。
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