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摘要：为了解猪圆环病毒3型（porcine circovirus type 3，PCV3）在云南省的流行及遗传进化情况，2020年10—12月收集云南省部分猪场疑似病料共24份，采用PCR方法进行PCV3病原检测；选取PCV3阳性扩增产物进行克隆测序，并将测序结果与16株国内外参考毒株进行ORF2核苷酸序列同源性分析。结果显示：24份病料样品中检出阳性5份，阳性检出率为20.8%；克隆出的阳性扩增产物（YNJS-2020）ORF2核苷酸序列和国内外参考毒株的同源性较高，为97.4%~98.9%，其中与西班牙毒株MF80572000同源性最高，与安徽14-201611毒株同源性最低。结果表明，云南省存在PCV3流行，且流行毒株与国内外其他毒株遗传关系较近，但也有一定差异。结果提示，云南省应加强对PCV3的监测及其流行的控制，避免PCV3大面积流行。本研究为云南省PCV3基因型分析和疫苗研究提供了一定的数据基础。
猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）由德国科学家Tischer于20世纪70年代首次从猪肾脏传代细胞中被发现，当时业界对该病原认识较浅，因而对其并未重视。目前已发现的PCV有PCV1、PCV2、PCV3和PCV4型。PCV1没有致病性，但PCV2具有严重致病性，可以引起多种临床症状，如断乳仔猪多系统衰竭综合征、仔猪先天性震颤、猪皮炎和肾病综合征、增生性和坏死性肺炎等。2016年Palinski等借助宏基因测序技术，从发病母猪及流产胎儿体内首次鉴定出PCV3。2017 年我国首次报道发现PCV3。目前PCV3在我国广东、山东、河北、辽宁、江西、重庆、福建、湖南等多个省市均有流行。2019年4月，周继勇团队从患有猪呼吸道疾病、腹泻、猪皮炎与肾病综合征的猪群中发现了一种新型PCV，并将其命名为PCV4。
PCV3为单股环状DNA病毒，无囊膜，大小约2 000 bp，直径约17~20 nm，是至今发现的所有病毒中能进行自主复制的最小哺乳动物病毒。PCV3含有3个主要开放阅读框（ORF），即ORF1、ORF2和ORF3。其中：ORF1编码Rep蛋白，主要参与病毒复制；ORF2编码的Cap蛋白，可诱导机体产生特异性免疫应答；而ORF3编码蛋白的功能还没有具体研究。本研究对云南省不同地区猪场的病料进行PCV3 PCR检测，并截取其ORF2核苷酸序列，分析其与参考毒株间的同源性，以揭示云南省PCV3的遗传变异情况，从而为该病诊断和防治提供依据。
材料与方法
材料
病料样品 24份病料采自于云南省建水、宣威、瑞丽以及石屏等地区不同猪场疑似PCV感染的病猪及其所产木乃伊胎的脾脏、肺脏和淋巴结。
方法
引物设计与合成 根据GenBank中公开发表的PCV3基因序列，利用Oligo7软件设计1对引物（PCV3-F：CCCACATGCGAGGGCGTTTACC；PCV3-R：CGAGGCCGCTTCATCATCCACT）扩增ORF2基因，扩增片段长度为895 bp。引物由昆明擎科生物科技有限公司合成。
病毒DNA提取 按照TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0说明书，对样品上清进行DNA提取。
PCR检测 利用PCV3检测引物PCV3-F、PCV3-R，对上述提取的样品DNA进行PCR扩增。PCR反应体系25.0 μL：2×Easy TaqSuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，上、下游引物及DNA各1.0 μL。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，扩增34个循环；72 ℃延伸5 min。反应结束后，将PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察结果并拍照。使用EasyPure Quick Gel Extraction Kit回收目的片段。
克隆与纯化基因鉴定 采用TA克隆，按照宝日生物工程（大连）有限公司TaKaRa pMDTM19-T Vector Cloning Kit和TaKaRa E.coil DH5α Competent Cells说明书进行。使用购自GenStar公司的质粒提取试剂盒，按照说明书从培养好的菌液中提取重组质粒进行PCR鉴定，对产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
测序及序列分析 将菌液送至昆明硕擎生物进行测序。利用DNAstar软件，对其中1份阳性扩增产物（命名为YNJS-2020）测序结果与GenBank中16株PCV3参考毒株（表1）进行ORF2核苷酸序列同源性分析，并通过MEGA7.0软件绘制系统发育进化树。
结果
PCR扩增
对PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳分析，结果在895 bp左右位置可见清晰的特异性条带，与预期相符（图1）。
核苷酸同源性分析
使用DNAstar中的Megalign软件，对YNJS-2020测序结果与GenBank中的16株参考毒株进行ORF2核苷酸序列同源性分析。结果（图2）显示：第一，YNJS-2020与16株参考毒株同源性为97.4%~98.9%，其中与西班牙737-8-Spain-2017毒株同源性最高，为98.9%；与安徽14-201611毒株同源性最低，为97.4%。第二，YNJS-2020与韩国PCK3-1702毒株、山东2-201703毒株、山东1-201703毒株、泰国PB01-17毒株的同源性相同，均为97.8%；与上海0708-2016毒株、湖北618-2016毒株、河南13-2016毒株以及巴西BR-RS-6毒株、美国MO2015毒株的同源性都为98.0%。第三，YNJS-2020与其他毒株（IT-CO2017、GXHJ1-2017、CHN-CC2016，CHNCC2016和HZ4-2015）的同源性都在98.0%以上。
ORF2核苷酸序列系统进化树分析
用MEGA 7.0软件对YNJS-2020与GenBank中16株参考毒株的ORF2核苷酸序列进行遗传进化分析，绘制系统进化树。分析结果（图3）显示：第一，YNJS-2020与意大利IT-CO2017、广西GXHJ1-2017、江西CHNCC2016、上海0708-2016、广东HZ4-2015、吉林CHN-CC2016等毒株的同源性相近，形成了一个亲缘关系较近的分支；第二，YNJS-2020与西班牙737-8-Spain-2017毒株的同源性最高，表明这两个毒株之间的亲缘关系最近；第三，YNJS-2020与韩国PCK3-1702毒株、山东2-201703毒株、山东1-201703毒株、泰国PB01-17毒株位于两个不同的分支，表明YNJS-2020与这几个毒株的亲缘关系较远，而与安徽14-201611毒株的亲缘关系最远。
讨论
PCV是公认的危害猪群最严重的病原之一。自2016年美国鉴定出第一株PCV3以后，我国各地相继发现了PCV3的存在。本研究采集了云南省不同地区猪场的病料。被采集病料的病猪分别出现皮下水肿、皮肤不规则隆起，母猪表现体温升高，产木乃伊胎。针对有此临床症状的24份病料进行PCV3病原检测，发现阳性检出率达到20.8%，说明云南省猪群中存在PCV3流行。据报道，2017年华中农业大学曾对重庆、湖南等11个省市收集的222份样品进行PCV3病原检测，检出阳性77份，阳性率为34.7%。而本研究24份病料样品的阳性检出率为20.8%，说明云南省的PCV3流行程度可能低于这11个省份。
本研究对YNJS-2020与国内外分离毒株进行ORF2基因序列比对，发现其与西班牙737-8-Spain-2017毒株同源性最高，表明这两个毒株之间的亲缘关系最近，因此怀疑该毒株的来源可能与国外引种有关，但要确定其具体来源较困难。YNJS-2020与部分参考毒株位于不同分支，表明其亲缘关系较远，其中与安徽14-201611毒株亲缘关系最远，这应引起云南省今后在PCV3疫苗株筛选研究中的注意。
结论
本研究确定云南省猪群中存在PCV3感染，且流行毒株与GenBank里选取的国内外参考毒株同源性较高，尤其与国外毒株同源性最高，提示其来源可能与国外引种有关，但也存在一定差异。建议云南省加强PCV3监测及其流行控制，同时在今后疫苗株筛选研究中注意毒株间的同源性。
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