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摘要：为掌握安徽省A型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）感染情况，2019年春季和秋季开展了两次横断面研究。用估计流行率方法，每次随机选取包括种禽场、蛋禽场、肉禽场、活禽批发市场、农贸市场、自然村和野禽栖息地在内的约193个场点，再用发现疫病抽样策略，在每个场点采集20份家禽咽喉-泄殖腔双拭子、环境拭子或野禽粪便棉拭子样品，使用荧光RT-PCR检测试剂盒进行A型AIV核酸检测，对检测阳性的再进行H5、H7和H9亚型分型。结果显示：春、秋两季AIV群体表观流行率分别为17.9%、12.6%，群体真实流行率分别为16.4%（95%CI：11.2%~21.6%）、10.4%（95%CI：6.1%~14.7%）；春、秋两季在规模养殖场、自然村散养户、活禽批发市场和农贸市场均检出了A型AIV，其中H9亚型阳性率分别为6.2%、4.2%，未检出H5、H7亚型；A型AIV流行率无地理和季节上的显著差异（P＞0.05），但春、秋两季的活禽市场流行率比（prevalence ratio，PR）分别是养禽场的2.2倍（95%CI：1.2~4.2）、2.3倍（95%CI：1.1~5.0）。结果表明，2019年春、秋两季A型AIV在安徽省养殖和交易环节均存在不同程度的污染，其中交易环节流行风险较大，因此要特别注重活禽交易市场和农贸市场的禽流感防控。
禽流感（avian influenza，AI）是由A型禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的禽类传染病，最早在意大利报道发生。A型AIV有15种亚型可感染禽类，但高致病性AI主要由H5和H7亚型引起，并可感染人。在我国，AI多发生于春季和秋季，是国家动物疫病监测计划中重点监测的动物疫病之一。为掌握安徽省AIV的分布和流行情况，2019年4—6月（春季）和10—12月（秋季），分别对安徽省家禽养殖场、活禽批发市场、农贸市场、自然村散养户及野禽栖息地开展了AIV群体流行率横断面研究，以期为科学防控AI提供技术支撑。
材料与方法
目标群
以安徽省境内的种禽场、商品蛋禽场、商品肉禽场等家禽养殖场，活禽批发市场和农贸市场等交易市场，以及自然村散养家禽和野禽栖息地野禽为目标群。
抽样策略和样本量
采取先抽取群体再抽取个体的两阶段抽样策略。（1）群体水平，采用估计流行率方法计算样本量。预设群体流行率（p）为15%，置信水平（CL）为95%，可接受误差（d）为5%，带入公式：N=1.962×p（1-p）/d2，计算所需场点数为193个。采用分层随机抽样法，参考相关平台数据中各种类型场点的比例并结合实际，抽取不同类型的场点（表1）。（2）个体水平，按照发现疫病方法计算样本量。设预期个体流行率15%、置信水平95%，假设试验敏感性和特异性均为100%，带入公式：n=[1-（1-CL）]1/D×[N'-（D-1）/2]（N'为存栏量或当日交易量，野禽为无限群，D为预期群体中的感染数量），则每个场点需采集17~19份样品。为方便基层操作，统一为每个场点采集20份样品。
样品采集
在每个家禽养殖场，采集20份家禽咽喉-泄殖腔双拭子；在每个活禽交易市场和农贸市场，采集3个档口或摊位5份家禽双拭子，同时采集5份环境拭子（污水沟、地面、墙面、笼具、车轮污物或宰点脱毛机等）；以自然村为流行病学单元，每个村采集不少于4户散养家禽的双拭子共20份；在每个野禽栖息地，采集20份新鲜野禽粪便拭子。
实验室检测
将背景信息相同的5份样品混合成1份混样，用A型AIV荧光RT-PCR试剂盒（深圳澳东，批号5B008、60084）进行检测，只要检出1份混样为阳性，则该样品来源场点被定义为阳性场点。
数据分析
群体表观流行率 一般情况下，群体表观流行率（HAp）为检测到的阳性群占抽样研究群的比值。
群体真实流行率 用相关文献的方法，对分层得到的阳性率直接进行标准化计算后，与检测试验敏感性（Se）、特异性（Sp）、群体内个体抽样数量（n）一起，带入公式HSe=1-[1-p×Se-（1-p）（1-Sp）]n和HSp=Spn，HTp=（HAp+HSp-1）/（HSe+HSp-1），计算群敏感性（HSe）、群特异性（HSp）和群体真实流行率（HTp）。
群体流行率的95%置信区间（CI） 根据公式HTp±Z√HTp×（1-HTp）/N计算，其中Z为正态分布中概率为0.05所对应的值1.96，N为抽取的场点数。
统计方法 用SPSS 20.0软件，对相关数据进行卡方检验和Fisher's确切检验。
结果
A型AIV流行率
春、秋两季A型AIV的HAp分别为17.9%、12.6%，二者差异不显著（P＞0.05），标准化率分别为17.4%和12.4%（表1）。参考A型AIV荧光RT-PCR试剂盒的试验敏感性（Se=99.0%）和特异性（Sp=99.9%），计算得HSe=96.1%，HSp=98.0%。春、秋两季A型AIV的HTp分别为16.4%（95%CI：11.2%~21.6%）、10.4%（95%CI：6.1%~14.7%）。
空间分布
检测结果（图1）显示：春、秋两季分别在10个地级市26个县（区、市）、9个地级市21个县（区、市）检出A型AIV核酸阳性；全省16个地市中，有6个两次均检出阳性，分别是六安、马鞍山、宣城、铜陵、安庆和黄山。春、秋两季检出阳性的地级市或县（区、市）数量占对应总数的比例没有统计学差异（P＞0.05）。
群间与时间分布
不同类型 对春、秋两季的养禽场、活禽市场、自然村散户、野禽栖息地的A型AIV群体阳性率，分别按群间、时间进行分组并进行两两比较，经卡方检验或Fisher's确切检验发现：春、秋两季活禽市场与养禽场的差异均有统计学意义（P＜0.05），春、秋两季活禽市场A型AIV流行率比（prevalence ratio，PR）分别是养禽场的2.2倍（95%CI：1.2~4.2）、2.3倍（95%CI：1.1~5.0）；种禽场、蛋禽场和肉禽场的群阳性率均无群间和时间上的统计学差异（P＞0.05）。活禽批发市场和农贸（零售）市场之间的群阳性率也无群间和时间上统计学差异（P＞0.05）。具体结果见表2。
不同种类 对养禽场、交易市场和散养户不同种类阳性样品分布情况进行统计，结果春、秋两季均在鸡咽喉-泄殖腔拭子样品中检出A型AIV核酸阳性，春季还在番鸭中检出阳性，秋季在鹅中检出阳性，两次均未在野禽粪便拭子样品中检出阳性。在活禽批发市场和农贸市场的环境拭子样品中两次均有阳性检出。按样品类型分组并进行两两比较，经卡方检验或Fisher's确切检验发现，除秋季鹅与野禽两组差异显著外（P＜0.05），其他均差异不显著（P＞0.05）；对春、秋季各组进行两两比较发现，除春季鸡样品阳性率较高且有统计学意义外（P＜0.05），其他各组均差异不显著（P＞0.05）。与水禽和野禽相比，鸡群和活禽市场环境中的A型AIV流行率比没有统计学意义（PR的95%CI穿过1）。具体结果见表3。
分型检测
对A型AIV核酸阳性样品进行H5、H7、H9亚型分型，结果H5、H7亚型均呈荧光RT-PCR阴性，H9亚型春、秋季的HAp分别为6.2%（12/195）、4.2%（8/191）。
讨论
从流行病学意义上讲，2019年春秋季安徽省A型AIV群体流行率有95%的可能性在6.0%~22.0%之间。2018年的监测结果也在这个范围之内。通过多年连续监测，结合流行病学抽样方法的运用和优化，大致掌握了安徽省A型AIV流行率范围。从2017年H7N9疫苗应用后，H7亚型AIV监测结果均呈阴性。同时，连续6次的监测也没有检出H5亚型AIV阳性。A型AIV核酸阳性样品中，H9亚型的比例约占1/3，另外的2/3属于哪些亚型尚未进行检测，这可以在今后工作中作深入研究。此外，对于H9亚型阳性样品，可以与高级别实验室开展合作，探索进行基因测序和分子流行病学等方面研究。2021年国内出现了多起H5N8亚型AI疫情，因此需要继续开展相关监测，查明安徽省是否有存在该亚型病毒。
2019年春秋季，安徽省活禽交易环节的A型AIV流行率比养殖环节的高，这与诸多研究的结论一致，也与安徽省多年的监测结果一致，但在地理位置、春秋季节、家禽种类、家禽用途等方面没有显著差异。因此，在活禽交易市场和农贸市场较多的地方，要特别注重这些场所的防疫设施改造和生物安全管理，加强检疫监管和卫生监督，加强清洗消毒和休市制度的执行，加强转变消费习俗的宣传，推行“冰鲜上市”，防止病毒向养殖环节传播和扩散。
2019年的监测结果与往年类似，但2019年每次监测的场点数量减少了近一半，每个场点的抽取样品数量也因抽样策略的改变而减少。因此，从群体和个体水平都大大节省了人、财、物等监测成本。在可操作性上，基层抽样人员由于对流行率、可接受误差等专业术语理解能力有限，对每个场点选择的个体样本数量也达不到一致，因而给数据分析带来困难。本次探索性使用发现疫病的策略抽取个体，虽然结果不能用来估计个体水平的流行率，但由于统一了样本数量，既方便了前端的采样操作，又方便了后端的数据统计。
春秋季两次监测的局限性在于监测场点中自然村数量稍显不足。这一方面由于养禽业向集约化、规模化发展，散养家禽数量减少；另一方面，基层队伍待遇低、老龄化、人员少，已无法满足监测采样等防疫需求。以安徽省畜牧业大县望江县为例，截至2020年底，全县村级防疫员数量由160多人缩减至不足70人。对于流行病学单元结构层次较为复杂的全省范围监测，需要建立一支稳定的、高水平的基层队伍，充分挖掘基础数据，构建科学抽样框，分层开展专项监测，以获取科学精确的监测结果，从而为动物疫病精准防控奠定基础。
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