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摘要：禽大肠杆菌病是养禽业广泛存在的细菌性疾病，是造成禽肉产品废弃及药物治疗费用高的重要原因。为了解近年来山东省禽源致病性大肠杆菌的流行及其耐药性演化情况，对2016—2020年疑似患病禽进行致病性大肠杆菌分离鉴定和耐药性检测。从山东省12个地市的105 份病料中共分离到93株致病性大肠杆菌。PCR检测发现，禽致病性大肠杆菌与其他呼吸道病原的混合或继发感染较严重，其中与H9亚型禽流感病毒等病原的二重感染率为67.74%，多重感染率为11.83%，而禽致病性大肠杆菌单一感染率仅为20.43%。耐药检测发现：分离菌株对阿莫西林、氨苄西林和多西环素的耐药率较高，分别为100%、98.21%和94.59%；对丁胺卡那霉素和阿奇霉素的耐药率较低，分别为20.43%和13.33%；对复方药物氨苄西林/舒巴坦和阿莫西林/棒酸的耐药率也相对较低，分别为40.91%和17.86%；94.62%的分离菌株对3种及以上药物产生耐药。研究表明，山东省禽源致病性大肠杆菌流行形势严峻，且耐药程度严重，应加快新抗菌药物及复合型抗菌药物研发，减少并合理使用抗菌药物，禁止滥用。
禽大肠杆菌病是由禽致病性大肠杆菌（avian pathogenic E. coli，APEC）引起的局部或全身性感染的疾病，可通过呼吸道、消化道及生殖道等多种途径传播，引起多种临床病变，包括败血症、气囊炎、腹膜炎、肿头综合征、全眼球炎、关节炎、输卵管炎、肉芽肿、蜂窝织炎（炎症过程）及脐炎/卵黄囊炎等。大肠杆菌病是目前在养禽业广泛存在的感染性细菌病，居各种细菌性疾病之首，且极易与多种病毒，如新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、传染性支气管炎病毒（IBV）等发生并发或继发感染，导致家禽死淘率增加、生长缓慢、生产性能下降、饲料报酬率降低、胴体废弃率升高，从而引起较大经济损失。
禽大肠杆菌病在我国普遍流行，混合或继发感染严重，主要危害商品肉鸡和肉鸭。近年来，常发生APEC与NDV、IBV、H9亚型AIV等病毒的混合感染，导致商品肉鸡出现气囊炎、支气管栓塞、肝周炎、心包炎等病症，死淘率高达30%，造成了严重经济损失。不仅如此，种鸡、蛋鸡、鸭、鹅、鸽子、鹌鹑等也深受APEC侵害。据不完全统计，我国每年因APEC而病亡的鸡在4 000万只以上，经济损失数十亿元。
由于抗菌药物在临床中的过度使用，导致大肠杆菌耐药谱越来越广，多重耐药性加重，给该病防治带来了较大挑战。因此，了解APEC的地区流行特点以及耐药模式，对大肠杆菌病防治具有重要意义。本研究对2016—2020年山东省12个地市不同禽养殖场收集的105份病料进行APEC分离鉴定，并对分离的93株菌株进行耐药模式分析，以期为禽大肠杆菌病防治提供依据。
材料与方法
质控菌株
大肠杆菌ATCC 25922，购自中国兽医药品监察所。
APEC分离鉴定
采集潍坊、滨州、枣庄等12个地市一年四季送检的105批次具有典型心包炎和肝周炎病症的鸡（鸭）心、肝组织样品，划线接种于麦康凯琼脂和伊红美蓝琼脂鉴别培养基，37 ℃培养20 h，观察菌落颜色、形态及革兰氏染色后的菌体形态。
其他呼吸道病原检测
根据GenBank中已发表的NDV、AIV、IBV、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡毒支原体（MG）、滑液囊支原体（MS）等病原特异性保守区序列，合成相应病原的检测引物，对1.3中相应发病禽的气管或气囊组织进行PCR检测。
药敏试验
根据2019年美国国家临床实验室标准化委员会（CLSI）颁布的操作标准，选取氨苄西林等21种抗菌药进行药敏试验，依据抑菌圈直径判定敏感株、中介株（中等耐药株）和耐药株（表1）。通过SPSS 15.0软件，对不同地市及不同禽种类分离的APEC耐药数据进行配对样本t检验。
多重耐药模式分析
依据2012年欧洲疾病预防和控制中心（ECDC）对多重耐药（MDR）的定义和肠杆菌科MDR判定标准，从临床常用的6大类兽用抗菌药物中选择代表性药物，包括阿莫西林（β-内酰胺类）、多黏菌素（多肽类）、环丙沙星（喹诺酮类）、多西环素（四环素类）、卡那霉素（氨基糖苷类）和氟苯尼考（氯霉素类），根据药敏试验结果分析APEC的多重耐药模式。
结果
APEC分离鉴定
分离菌株在麦康凯琼脂平板上培养20 h后，可见圆形、表面光滑湿润、直径为1~2 mm的粉红色菌落；该菌落在伊红美蓝平板上呈紫黑色，并带有绿色金属光泽；将培养物进行革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性杆菌，大小为2~3 μm×0.4~0.7 μm（图1），符合大肠杆菌生物学特性。
经培养特性和细菌形态分析，从采集的105份组织病料中共分离到93株APEC，分离率为88.57%。气温多变寒冷的冬春季节分离率较高，共分离到56株（60.22%）；温差变化较小的秋季次之，分离到22株（23.66%）；夏季最低，分离到15株（16.13%）。APEC主要分离自舍内湿度大、垫料污染严重的鸭场。中小型养殖场分布较多的潍坊市分离到的菌株最多，共有34株，其次是淄博、枣庄及济南等地（表2）。
混合感染检测
在进行APEC分离的同时，对相应发病禽气管和气囊渗出物，进行H9亚型AIV、NDV、ILTV、IBV、MG、MS等的PCR检测。结果（图2）显示：单纯APEC感染19例（20.43%），APEC与H9亚型AIV等其他呼吸道病原的二重感染63例（67.74%），多重感染11例（11.83%）。
耐药性检测
21种常用抗菌药物对分离株的药敏试验结果（表3）显示：分离菌株对阿莫西林（β-内酰胺类）、氨苄西林（β-内酰胺类）和多西环素（四环素类）耐药率较高，分别为100%、98.21%和94.57%；其次是氟苯尼考、头孢拉定和恩诺沙星，耐药率分别为82.35%、84.52%和88.63%；而对丁胺卡那和阿奇霉素较敏感，耐药率分别为20.43%和13.33%；对其他抗菌药的耐药率介于35.38%%~79.57%。不同地市及不同禽种类分离的APEC耐药率无显著性差异（P＞0.05）。
耐药统计结果（图3）显示：93株菌中，0耐药的菌株数量为0，对1~2种药物耐药的5株，其余88株（94.62%）对3种及以上药物耐药；耐16种药物的菌株数量最多，有11株，有2株菌对所有的21种药物均耐药。
耐药模式分析
对代表性药物的多重耐药性分析结果（表4）显示：93株APEC中，共有16种耐药类型，其中3重及以上耐药菌株共有85株，占91.40%。APEC对四环素类、β-内酰胺类药物、酰胺醇类、喹诺酮类、氨基糖苷类和大环内酯类药物的平均耐药率分别为94.57%、89.88%、82.35%、71.61%、63.98%和13.33%，即表现为对抑制胞壁黏肽合成酶的β-内酰胺类、作用于核糖体50S阻挠蛋白质合成的酰胺醇类和光谱抑菌的四环素类药物产生了较强的耐药性。
对比2016年22株和2020年23株APEC的对不同类别抗菌药物的耐药性，可以看出2016年呈现2~6重耐药模式，有11种耐药类型，多重耐药率为81.82%，到2020年耐药严重程度升级，表现为3种耐药类型的4~6重耐药，多重耐药率为100%（图4）。
讨论
耐药形势更加严峻
本研究分离鉴定的93株APEC来源于山东省12个地市的20多个规模化养禽场。分离株对氟苯尼考、氨苄西林及头孢噻肟等多种常用兽用药物耐药率高，耐药程度较2015年前更加严重，仅对较少使用的多黏菌素耐药率略低；对尚未在畜禽上应用的第三代头孢他啶和头孢哌酮也产生了一定的耐药，耐药率分别为64.37%和54.84%；而对丁胺卡那霉素和阿奇霉素较敏感，耐药率分别为20.43%和13.33%。近5年分离的APEC中，3重及以上耐药的菌株有85株，占91.40%，其中2016年分离的22株APEC呈现为2~6种耐药，有11种耐药类型，多重耐药率为81.82%；而2020年分离的23个菌株耐药类型有3种，表现为4~6重耐药，多重耐药率达到100%。这与国内同期耐药基因的检测结果一致，表明山东省APEC多重耐药现象有加重趋势。
耐药性加重的原因
大肠杆菌耐药性的产生有其天然适应性。1940年Abraham和Chain从大肠杆菌中分离鉴定出了一种能水解青霉素的酶，说明在未使用抗生素之前，部分大肠杆菌就存在着对青霉素类药物的耐药性，这是其在不利环境中的适应性生存能力。但目前耐药性加重的趋势与抗菌药物的广泛应用、不合理使用密切相关。某些养殖场（尤其是商品肉鸡场）为防止大肠杆菌病及其他细菌性疾病的发生，长期低剂量预防性用药，未使用敏感性药物或随意加大剂量治疗，这是加速耐药性产生的重要原因。细菌可通过主动改变自身的代谢途径或药物靶位点蛋白结构，使其不被抗菌药物杀灭。质粒上携带的多种耐药基因，可从耐药菌株转移到同种或其他不同种的敏感菌株质粒或染色体上，因此耐药基因在不同菌种的耐药性传递中起着主要作用。研究表明，在减少抗菌药使用后6个月后，APEC的耐药性或耐药基因仍然存在。
综合防控
首先要加快新抗菌药物及复合型抗菌药物研发，包括中药、噬菌体等新型抗菌剂。克拉维酸也称棒酸，一种不可逆性竞争型β-内酰胺酶抑制剂，对金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性杆菌的β-内酰胺酶均有抑制作用，可显著提高青霉素类和头孢类抗生素的抗菌活性。本试验表明，阿莫西林的耐药率为100%，而阿莫西林/克拉维酸（棒酸）复方药物可将禽源大肠杆菌的平均耐药率降至17.86%，证实阿莫西林与棒酸具有协同增效作用。
其次，禁止抗菌药物滥用。2016年8月国家卫生计生委、科技部、农业部等14部门制定出台了《遏制细菌耐药国家行动计划（2016—2020年）》，2018年4月农业农村部下达了《兽用抗菌药使用减量化行动试点工作方案（2018—2021年）》，要求在家禽养殖饲料中，不添加任何抗生素、激素以及其他外源性药物，在家禽养殖中将抗菌药的使用严格限制在疾病治疗范围内。
最后，要多措并举，合理使用药物。一要加强饲养管理，消除诱发因素，强化卫生消毒管理；二要在高发地区，种禽开产前使用优势流行株的大肠杆菌灭活疫苗免疫，这样可有效降低产蛋期内的大肠杆菌病发病率，同时给雏鸡提供母源抗体保护；三要依据药敏试验结果，选择敏感药物进行合理治疗。
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