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摘要：为掌握广西地区导致猪群腹泻的主要病毒性病原的流行态势，为养殖场猪病毒性腹泻的综合防控提供依据，用实时荧光RT-PCR检测方法，对2017年1月—2021年6月广西14个地市489个猪场1 206份临床腹泻样品进行猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪轮状病毒（PoRV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪丁型冠状病毒（PDCoV）等病原检测，并分析其阳性检出率在不同年份、季节、地区、年龄段猪群之间的差异以及病原混合感染情况。结果显示，2017—2021年，PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV样品阳性检出率分别为49.67%、7.63%、4.56%和0.33%，场阳性检出率分别为53.37%、8.18%、8.18%和0.61%；病毒性腹泻病原有一定的季节性流行特征，多表现为冬、春季流行加重；PEDV、PDCoV普遍流行，PoRV局部流行，TGEV散发流行；4种病原对不同年龄段腹泻猪群的感染率存在差异，其中对哺乳仔猪危害最为严重；猪群以单一感染为主，主要为PEDV单一感染，阳性检出率为47.93%，混合感染均为二重感染且感染率较低。结果表明，导致广西地区猪群腹泻的主要病毒性病原主要为PEDV、PDCoV和PoRV，其中PEDV为最主要病原，其他病原也呈流行加重趋势，需进一步加强病原监测和疫病综合防控。
猪病毒性腹泻是由病毒引起的急性消化道传染病，主要病原为猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、猪轮状病毒（porcine rotavirus，PoRV）、猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus，TGEV）和猪丁型冠状病毒（porcine delta coronavirus，PDCoV）4种。猪群感染上述病毒后临床表现极为相似，均表现为腹泻、呕吐和脱水。猪病毒性腹泻发病急，传播速度快，各年龄段猪均易感，但仔猪病死率更高，感染情况更严重；耐过存活猪群生长发育迟缓，饲料转化率、日增重等明显降低，会增加养殖成本，给生猪养殖业造成巨大经济损失，严重制约生猪养殖业健康发展。
PEDV于1971年在英国育肥猪群和架子猪群中被首次发现。1978年在比利时分离到类似冠状病毒的病原CV777，通过致病性试验证实该分离病毒是引起猪病毒性腹泻的病原，随后该病原在世界各地广泛流行。2010年以来，随着新型PEDV变异毒株的出现，我国大部分省份大规模暴发了严重的猪病毒性腹泻疫情，哺乳仔猪病死率可高达100%。至今该变异毒株仍对我国乃至世界范围内生猪养殖业构成巨大威胁。Woode和Bridge于1974年在英国首次分离出PoRV。随后多个国家及地区相继检测到该病毒，我国于1981年在腹泻仔猪粪便中首次分离到该病毒。TGEV于1933年在美国被首次发现，1946年首次由美国学者分离并鉴定。我国于1956 年首次报道在广东发现该病，随后在全国各地区都有该病发生和流行的有关报道。PDCoV于2012年首次在我国香港地区被发现。2014 年2月美国在猪腹泻粪便中首次检测到PDCoV，随后韩国和我国内陆地区多个省份也从猪腹泻样品中检测到该病原。
近年来，广西地区无论是大型规模化养猪场还是生猪个体养殖户均出现了严重的病毒性腹泻疫病，给广西养猪业造成了严重经济损失，为摸清引起广西地区猪群腹泻的主要病毒性病原及其危害程度，了解本地区猪病毒性腹泻疫病的流行态势，2017年1月至2021年6月应用实时荧光RT-PCR检测方法，对广西14个地级市489个猪场送检的1 206份临床腹泻样品开展上述4种病毒性病原检测，并分析不同年份、季节、地区、年龄段猪群之间的差异以及病原混合感染情况，以揭示广西地区猪群病毒性腹泻疫病的流行状况、特点及规律，为进一步制定合理的综合防治措施提供技术依据，也为养殖场猪病毒性腹泻综合防控提供流行病学调查数据。
材料与方法
样品来源
本次调查的临床腹泻样品均为被动送检样品。2017年1月—2021年6月，广西14个地级市489个猪场先后自主送检临床上有腹泻症状猪只的肠内容物和粪便样品1 206份。自主送检猪场均为种猪场，猪场规模大小不一，母猪存栏量为50~8 000头。不同猪场送检的样品数量不一，猪场根据猪只发病情况随机采集临床腹泻样品，送检的样品数量跟猪场当时发病情况相关，与猪场规模大小无明确相关性。
病料处理及病毒RNA提取
取腹泻病猪的肠内容物和粪便样品，按体积比1:5加入生理盐水，在组织研磨器内进行研磨，反复冻融3次，4 ℃、12 000 r/min离心5 min，取上清200 μL，按照Axygen病毒基因组DNA/RNA快速抽提试剂盒说明书提取核酸，作为模板用于检测。
PEDV、PoRV和TGEV检测
严格按照相应的试剂盒说明书检测PEDV、PoRV和TGEV。结果判定：阳性对照Ct≤30并出现特异性扩增曲线，阴性对照无Ct值并且无特异性扩增曲线，试验结果成立。被检样品若FAM荧光信号Ct≤30并出现特异性扩增曲线为PEDV阳性；被检样品若HEV荧光信号Ct≤30并出现特异性扩增曲线为TGEV阳性；被检样品若CY5荧光信号Ct≤30并出现特异性扩增曲线为PoRV阳性。被检样品30＜Ct＜37并出现特异性扩增曲线，需重新取样提取RNA，扩增后进行结果判定，如仍是可疑，可判定为阳性；被检样品Ct≥37时，超过本方法检测灵敏度范围，判定为阴性；对于某些未呈现S型曲线，但本底较高的样品，判定为阴性。
PDCoV检测
严格按照相应的试剂盒说明书检测PDCoV。结果判定：阳性对照FAM荧光信号Ct＜38且HEX（VIC）荧光信号Ct＜38，并同时出现特异性扩增曲线，阴性对照FAM荧光信号Ct值无信号和HEX（VIC）荧光信号Ct值无信号并且均无特异性扩增曲线，试验结果成立。若被检样品FAM荧光信号Ct值有信号并出现特异性扩增曲线，判定为阳性；若被检样品FAM荧光信号Ct值没有信号并且无特异性扩增曲线，HEX（VIC）荧光信号有Ct值，并同时出现特异性扩增曲线，判定为阴性；若被检样品FAM荧光信号Ct值无信号和HEX（VIC）荧光信号Ct值无信号并且均无特异性扩增曲线，判定为无效。
数据处理与分析
2017年1月至2021年6月，应用实时荧光RT-PCR检测方法，对采自广西的1 206份临床腹泻样品分别进行PEDV、PoRV、TGEV、PDCoV等4种病毒性腹泻病原检测，并分析其阳性检出率在不同年份、季节、地区、年龄段猪群之间的差异以及病原混合感染情况。季节划分：3—5月为春季，6—8月为夏季，9—11月为秋季，12月至次年2月为冬季。同一份样品只检测到1种病原阳性为单一感染，同时检测到2种病原阳性为二重感染，同时检测到3种病原阳性为三重感染，依次类推。应用统计学软件SPSS 19.0，对检测数据进行卡方检验（χ2检验），统计分析其差异性，年份间采用χ2趋势检验分析。
结果与分析
不同病原检出情况
检测结果（表2）显示：2017—2021年，广西送检的临床腹泻样品中PEDV、PoRV、TGEV和PDCoV等4种病原均有检出，样品阳性检出率分别为49.67%、4.56%、0.33%和7.63%，场平均阳性检出率分别为53.37%、8.18%、0.61%和8.18%。PEDV在广西猪场送检的腹泻样品中样品阳性率和场阳性率均最高（P＜0.05），说明PEDV已成为导致广西猪群腹泻的最主要病毒性腹泻病原。
不同年份检出情况
由表2可知：2017—2021年，PEDV阳性检出率整体呈波浪状下降趋势，2018年样品阳性检出率和场阳性检出率均最高，2020年最低，差异显著（P＜0.05），2021年阳性检出率相比2020年略有升高，但差异不显著（P＞0.05），各相邻年份间差异不显著（P＞0.05）；PoRV阳性检出率呈逐年升高趋势，各相邻年份间差异显著（P＜0.01），2021年样品和场阳性检出率均显著高于2017和2018年（P＜0.05），也高于2019和2020年，但差异不显著（P＞0.05），说明其流行加重趋势开始减缓；TGEV总体阳性检出率较低，2017—2019年未有检出，2020年后有少量样品检出阳性；PDCoV阳性检出率呈波浪状变化，2017、2019、2021年阳性检出率较高，2018、2020年检出率较低，但各相邻年份间差异不显著（P＞0.05）。
不同季节检出情况
由表3可知：PEDV冬季样品和场阳性检出率均最高，其中样品阳性检出率与其他季节差异明显（P＜0.05），场阳性检出率显著高于夏季（P＜0.05），但与春、秋季差异不显著（P＞0.05）；PoRV春季样品和场阳性检出率均最高，与夏、秋季差异不显著（P＞0.05），但冬季阳性检出率最低，与其他季节差异显著（P＜0.05）；TGEV阳性检出率秋季略高，但一年四季间差异不显著（P＞0.05）；PDCoV春、冬季样品阳性检出率显著高于夏、秋季（P＜0.05），但各季节的场阳性检出率差异不显著（P＞0.05）。
不同地区检出情况
由表4可知：PEDV在广西14个地市均有不同程度感染，样品阳性检出率介于14.29%~75.86%，其中贵港、崇左、玉林检出率较高，超过60%，而河池最低，不足15%；PoRV在贺州、桂林、南宁等9个地级市有检出，阳性检出率较低；TGEV仅在南宁、桂林、防城港的样品中零星检出，阳性检出率极低；PDCoV除防城港外，在其他13个地市均有检出，说明PDCoV作为一种新发疫病开始在广西普遍流行，其中河池、北海、百色样品阳性检出率已超过20%。
不同年龄段猪群检出情况
由表5可知：PEDV在不同年龄段猪群中均有阳性检出，说明PEDV对各年龄段猪群均易感，但哺乳仔猪和后备母猪阳性检出率较高，显著高于公猪、母猪、保育猪和育肥猪（P＜0.05）；PoRV在后备母猪和保育猪中的阳性检出率偏高，但不同年龄段猪群间无显著差异（P＞0.05）；TGEV只在母猪、哺乳仔猪中有零星阳性检出，不同年龄段猪只阳性率差异不显著（P＞0.05）；PDCoV在母猪中的阳性检出率最高，显著高于哺乳仔猪和保育猪（P＜0.05），但与公猪、后备母猪、育肥猪差异不显著（P＞0.05）。
病原混合感染情况
由表6可知：腹泻样品以单一感染为主，总单一感染率为58.38%，其中PEDV单一感染率最高（47.93%），其次是PDCoV（6.72%）和PoRV（3.48%），TGEV最低（0.25%）；存在较低比例的二重感染，未发现三重及以上感染，其中二重感染主要表现为PEDV与其他病原的混合感染，不同混合感染类型间感染率差异不显著（P＞0.05）。
讨论
近年来，由腹泻造成的猪群死亡率不断升高，其中病毒的危害最为严重，给生猪养殖业造成了巨大经济损失，尤其是PEDV、PoRV、TGEV和PDCoV。为了解导致广西猪群腹泻的主要病原及感染程度，2017年1月—2021年6月共收集了广西14个地市489个猪场1 206份临床腹泻样品，进行上述4种病原的核酸检测，并对检测结果进行数据统计和分析，结果发现腹泻猪群中PEDV感染最严重，样品阳性检出率为49.67%。徐丽华等2011—2017年对浙江省不同地区猪临床腹泻样品进行了PEDV、PoRV、TGEV和PDCoV检测，发现PEDV阳性检出率最高，为71.25%；朱子健等2015—2016年对东北三省规模猪场的264份临床腹泻样品进行了PEDV、PoRV和TGEV的检测，也发现PEDV阳性检出率最高，为74.62%；路超等对2016—2018年天津市规模化猪场腹泻样品进行PEDV、PDCoV、TGEV、PoRV检测，发现PEDV阳性检出率最高，为51.28%；常新见等2017—2019年对华东地区35个场594份临床腹泻样品进行PEDV、PDCoV、PoRV、TGEV检测，发现PEDV阳性检出率最高，为62.6%。以上数据表明，广西和全国大部分省份检测结果一致，PEDV是引起猪病毒性腹泻的最主要病原。另外，广西也存在PDCoV、PoRV和TGEV感染，虽然总体发病率不高，但感染呈上升趋势，同样不容忽视。
从时间分布上发现，PEDV感染整体呈下降趋势，这可能与2019年国内发生非洲猪瘟疫情后生猪存栏量下降及猪场普遍加强生物安全管理密切相关。2021年PEDV感染有轻微抬头趋势，这可能与非洲猪瘟疫情得到控制后，生猪生产迅速恢复，存栏量逐渐升高有关。2017—2021年，PoRV阳性检出率逐年上升，说明PoRV感染日趋严重，可能原因是近年来广西猪场普遍放松了对PoRV的免疫预防，以及PoRV出现了多种基因型，导致市售疫苗达不到完全保护相关。TGEV虽然在2017—2019年腹泻猪群中未检出，但2020—2021年有零星检出，仍需持续关注。PDCoV感染在2021年出现上升趋势，应加强综合防控，避免PDCoV出现大规模流行。
猪腹泻的发生有明显的季节性，这与主要病原的流行特征有关。本研究发现，冬季PEDV感染率显著高于其他季节，而冬季PoRV感染率却较低，这与董波等研究发现闽西地区冬季PoRV感染率最高有较大差异，相关原因有待进一步探究；TGEV的季节性特征尚不明显，但其并非导致广西猪群腹泻的主要病原；PDCoV冬、春季感染率明显高于夏、秋季，这与路超等研究发现天津市PDCoV感染高峰期在春季和秋季不太一致，与施开创等、严瑾等研究发现的广西PDCoV在第二、三季度多发，存在一定差异。上述研究数据表明，猪病毒性腹泻一年四季均可发生，腹泻疫苗的免疫须列入常规免疫程序，进行常年免疫。
从空间分布上看，PEDV在广西14个地市均有分布且感染率较高，其中在贵港、崇左和玉林等生猪主产区尤为严重，样品阳性检出率均超过60%；PDCoV除未在防城港检出外，其他13个地级市均有不同程度感染。上述检测结果说明，PEDV和PDCoV在广西已普遍存在。PoRV在贺州、桂林、南宁等9个地市有检出，说明PoRV在广西呈局部性流行。TGEV只在南宁、桂林、防城港有零星检出，说明TGEV呈零星散发，并非导致猪群腹泻的主要病原。以上结果说明，广西地区应重点加强PEDV、PDCoV和PoRV感染的防控，建立健全生物安全防控体系，切断病毒传播途径，减少病毒扩散风险。
研究发现，不同年龄段猪只中，哺乳仔猪PEDV感染率显著高于公猪、母猪、保育猪、育肥猪，但与后备母猪差异不显著。哺乳仔猪腹泻跟后备母猪密切相关。据流行病学调查，绝大部分猪场都是从头胎母猪生产的哺乳仔猪开始发生腹泻，然后迅速扩散传播。哺乳仔猪腹泻发病率高可能跟后备母猪抗体水平普遍偏低、自身免疫系统不完善、抗病力弱等因素相关。保育猪、育肥猪感染率也较高，这是因为其死亡率偏低，腹泻疫苗价格较高，大部分猪场不对其进行免疫。与哺乳仔猪PEDV感染率显著高于母猪不同，哺乳仔猪PoRV感染率与母猪差异不显著，哺乳仔猪TGEV与PDCoV感染率均显著低于母猪，至于其原因，有待进一步探究。上述研究数据表明，虽然不同年龄段猪群中的PEDV、PoRV、TGEV和PDCoV感染程度有所不同，但各年龄猪群对其均易感，腹泻程度可能与猪抵抗力差异有关，成年猪多呈隐性感染，哺乳仔猪病死率最高，危害最为严重。
本研究对4种病毒单独感染和混合感染进行了统计分析，发现广西腹泻猪群的病毒性感染以单一感染为主，主要是PEDV单一感染，感染率为47.93%；混合感染均为二重感染，二重感染率为1.91%，主要表现为PEDV与其他病原的混合感染，未发现有三重及以上感染，说明广西腹泻猪群的病毒混合感染状况尚不严重，但需要加强防控。
结论
广西腹泻猪群主要病毒性腹泻病原检测发现：近年来PEDV已成为导致广西猪群腹泻的最主要病毒性病原，PoRV在广西呈局部流行且日趋严重，新出现的PDCoV有呈地方性流行趋势，TGEV仍为零星散发。上述病原主要表现为单一感染，但已出现二重混合感染。4种病毒性腹泻病原在广西不同地区、不同年龄段猪群和不同季节的流行特征并不明显，需要建立完善的猪场生物安全防控体系和科学的常规免疫程序来进行综合防控。
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