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摘要：为了解云南省鸡传染性贫血病毒（chicken anemia virus，CAV）的流行及其VP2基因变异情况，2017—2020年，在昆明市、楚雄州、大理州、红河州、玉溪市等家禽养殖密集区的89个鸡场，采集422份疑似病鸡肝脏样品，通过PCR方法检测CAV核酸。结果显示，检出阳性245份，平均阳性率为58.06%；不同年份的CAV核酸阳性率为53.61%~60.91%，不同区域核酸阳性率为51.68%~63.52%。对3份CAV阳性样品进行VP2基因序列分析，发现核苷酸序列同源性为99.6%~99.8%，与参考毒株1852TW和N7的核苷酸同源性为99.6%~99.8%，均属于GroupA分支。结果表明：云南省普遍存在CAV感染，且感染较严重；VP2基因仍可作为PCR病毒核酸检测的首选目标基因。通过加强鸡群CAV监测，淘汰阳性鸡群和结合疫苗免疫，可减少该病造成的损失。
鸡传染性贫血（chicken infectious anemia，CIA）是由鸡传染性贫血病毒（chicken anemia virus，CAV）引起雏鸡以贫血和免疫抑制为主要特征的传染病，根据临床症状又称鸡蓝翅病、出血综合征，早期也称为鸡贫血因子（chicken anemia agent，CAA），是危害我国家禽养殖的重要垂直传播疫病之一。该病1979年在日本被首次发现，1992年在我国被首次确认发生，现今已在全球范围内蔓延。2015年7月，该病病原被国际病毒分类协会归分于圆环病毒科。CAV核酸为环状单股负链DNA，基因组大小为2 298 bp或2 319 bp，编码 VP1、VP2和VP3蛋白。其中，VP2 为非结构蛋白，是CAV 最保守蛋白，因此在分子流行病学检测中VP2基因作为PCR检测的首选基因。为了解近年来CAV在云南省养鸡场的流行及其VP2基因变异情况，2017—2020年在昆明市、楚雄州、红河州、玉溪市等家禽养殖密集区，采集样品进行CAV核酸检测，并对部分阳性样品进行VP2基因序列分析。
材料
病料
2017—2020年，在昆明市、楚雄州、大理州、红河州、玉溪市等家禽养殖密集区，采集89个养鸡场的疑似肿瘤疫病病鸡肝脏样品，冷藏送实验室检测。
主要试剂及仪器
DNA核酸提取试剂盒、PCR 试剂盒和DL 2 000 DNA Marker等，均购自大连宝生物公司；超净工作台（型号为LA2-4A1），购自ESCO公司；PCR仪（型号为9700），购自美国ABI（Applied Biosystems Inc）公司；凝胶成像系统（型号为2000），购自美国BIO-RAD公司。
方法
病料处理
将每份肝脏组织样品剪碎，按1:5的体积比加入灭菌PBS研磨，将研磨后的混合物反复冻融3次，3 000 r/min离心10 min，取上清液提取核酸。
PCR检测
按照DNA核酸提取试剂盒说明书，分别提取上清液的DNA核酸。根据文献，合成CAV检测引物（CAVF：5'-AATGAACGCTCTCCAAGAAG-3'；CAVR：5'-AGCGGATAGTCATAGTAGAT-3'），预期扩增产物582 bp。反应条件：95 ℃，5 min；95 ℃，45 s，52 ℃，50 s，72 ℃，45 s，35个循环；72 ℃，10 min。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶，100 V电泳30 min，观察PCR扩增结果。
VP2基因扩增和序列分析
将PCR检测的代表性阳性样品扩增后，按照胶回收试剂盒说明进行DNA回收。回收的DNA送昆明硕擎生物测序。采用MegAlign软件，对VP2基因进行序列比对和系统发育分析。
结果与分析
PCR检测
2017年1月—2020年12月，在昆明市、楚雄州、大理州、红河州、玉溪市的89个鸡场共采集422份样品，检出CAV核酸阳性245份，平均阳性率为58.06%。部分阳性样品PCR产物琼脂糖凝胶结果见图1。不同年份的核酸阳性率为53.61%~60.91%（表1），不同地区的核酸阳性率为51.68%~63.52%（表2），差异均不显著（P＞0.05）。
VP2基因序列分析
自GenBank数据库下载国内外已知的CAV VP2基因序列，采用MegAlign软件进行序列比对和系统发育分析。序列比对及系统发育分析结果（图2）显示：3份CAV阳性样品VP2基因核苷酸序列同源性为99.6%~99.8%，与其他参考毒株1852TW和N7之间的核苷酸同源性为99.6%~99.8%，均属于Group A分支，与Group C分支的Australian毒株同源性为98.2%~98.4%，与Group B分支毒株的同源性为99.5%~99.6%。
讨论
CAV感染后，是否表现临床症状与鸡的年龄、毒株毒力以及伴发或继发其他疫病等因素有关。该病主要表现为皮肤、喙、肉髯和可视黏膜苍白以及发育迟缓、精神沉郁、消瘦等临床症状，如果仅为单一感染，没有并发和继发其他疫病病原感染，则死亡率较低或表现一过性临床特征。如果继发其他病原感染，则可阻碍病鸡康复，使病死率增高。在血清流行病学调查中发现，该病的死亡率与饲养环境、营养因素等密切相关，饲养环境好、饲料营养佳的鸡场虽检测到CAV核酸阳性，但临床症状不明显，经济损失也小。李岳等对我国部分地区进行血清流行病学调查发现，13个省市疑似发病的381个鸡群中CAV群阳性率为12.50%~50.00%，普遍存在于调查的 13个省市中。另外有文献报道，黑龙江、广西和安徽等省区的CAV核酸阳性率为39.35%。本次检测的云南省CAV核酸阳性率为58.06%；李珂等在云南省地方品种鸡群4种垂直传播病毒血清流行病学调查中发现8个地方品种鸡群的CAV抗体阳性率为98.47%。上述数据表明，云南省CAV感染率较高，说明该病防控对于云南省家禽养殖业更为重要。CAV与马立克病毒（MDV）、禽白血病病毒（ALV）、禽网状内皮组织增殖病毒（REV）等其他免疫抑制性病原双重或三重混合感染率为52.94%。本次检测也发现了CAV与 MDV、ALV混合感染病例，表明 CAV 与其他免疫抑制性病毒混合感染现象普遍存在。另外，也有CAV与新城疫病毒（NV）、禽流感病毒（AIV）混合感染的报道。由于CAV在临床症状和病理变化方面的表现没有MDV、ALV、NDV、AIV感染明显，因此该病往往被养殖者忽视。
本次检测发现，CAV阳性样品的VP2基因核苷酸序列同源性为99.6%~99.8%，与其他CAV毒株VP2基因的核苷酸同源性也在98.2%以上，均属于Group A分支，与国内流行毒株以Group A 群为主的报道一致。因此，在该病毒核酸检测中，VP2基因仍可作为PCR检测的首选目标基因。通过加强鸡群CAV监测，淘汰阳性鸡群和结合疫苗免疫，可减少该病造成的损失。
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