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摘要：为了解鸡传染性支气管炎病毒（IBV）在我国的流行规律，通过RT-PCR方法，对2019—2021年从我国29个省级行政区送检的38 442份疑似IBV感染样品进行病原检测和鉴定，对检出的阳性样品进行S1基因测序分型，然后对检测结果进行时间、空间和群间统计分析。结果显示：共检出6 436份IBV阳性样本，阳性检出率为16.7%。2019—2021年的IBV阳性检出率分别为12.5%、16.4%、21.0%，呈逐年增长趋势：阳性检出率呈现一定的季节性变化特点，7—9月检出率（11.3%~15.4%）较低，而3—6月（17.3%~19.3%）和10—12月（17.5%~19.0%）较高。全国29个省级行政区中有27个检出阳性样品，其中东部和中部家禽养殖密集区阳性检出率较高，而西部和北部地区较低。白羽肉鸡阳性检出率最高（28.9%），肉种鸡阳性检出率最低（5.0%），0~6周龄阶段IBV感染较为严重。共检出5种基因型，其中QX型（66.5%）、GVI型（27.7%）占比较高，为当前流行的优势基因型；不同品种鸡群中流行的基因型存在一定差异，白羽肉鸡群中以QX和GVI型为主，而其他鸡群中流行的基因型较为复杂；QX型0~3周龄（33.2%）、GVI型3~6周龄（66.4%）阳性检出数量占比较高，6周龄以后占比均较低（＜14.0%）。结果表明：我国鸡群中IBV感染普遍，尤其是家禽养殖密集区，且流行呈逐年加重趋势；冬春或秋冬季节多发，小日龄鸡群感染严重；流行基因型复杂，以QX型和GVI型多见。结果提示，我国的IB防控面临较大压力与挑战，需要加强优势基因型疫苗的研发，重点做好小日龄鸡群的IB防控。鸡传染性支气管炎（infectious bronchitis，IB）是由传染性支气管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）引起的一种急性、高度接触性传染病，给我国以及世界养禽业带来了巨大损失。小日龄雏鸡感染IBV后多表现“支堵”呼吸道或“肾肿”，成年产蛋鸡多表现“假母鸡综合征”和产蛋量下降。IBV基因型众多，且容易变异和重组，在不同地区和不同品种间引起的发病率差异较大，因此系统了解IBV在我国的流行特点以及不同基因型的流行规律，对防控该病具有十分重要的意义。为了解我国鸡群的IBV感染情况，2019年1月—2021年l0月，从山东、河南、辽宁等29个省级行政区收集疑似IBV感染样品，采用RT-PCR方法筛选阳性样本，并对背景信息明确的阳性样本进行时间、空间、群间的统计分析，总结2019—2021年IBV不同基因型的流行特点和规律，以期为我国IB防控提供参考。
材料
检测样品2019年1月—2021年l0月，从山东、河南、辽宁等29个省（自治区、直辖市）采集临床疑似感染IBV的白羽鸡、黄羽鸡、蛋鸡、肉种鸡的气管、肾脏、盲肠扁桃体等组织病料以及咽喉/泄殖腔棉拭子样品共38 442份。试剂RT-PCR试剂（一步法试剂盒）和Maker，为Takara公司产品；50×TAE buffer，为上海生工公司产品；Goldview核酸染料，为Labest公司产品；琼脂糖，为康为世纪公司产品；核酸提取纯化试剂盒，为杭州博日科技有限公司产品。仪器与设备超净工作台，DL-CJ-INDII，北京东联哈尔仪器制造有限公司产品；离心机，TD24-WS，Eppendorf公司产品；核酸提取纯化仪，NPA-32P，杭州博日科技有限公司产品；电泳仪，DYY-6C，北京六一生物科技有限公司产品；凝胶成像仪，JS-2000，上海培清科技有限公司产品；移液器，Eppendorf公司产品。
方法
病料RNA提取取气管、肾脏等组织病料约2 g，加入4~5 mL灭菌PBS或者生理盐水，置研磨器（灭菌）中研磨或者用剪刀细心剪碎，置-20 ℃中反复冻融3次，离心取上清备用。在棉拭子样本中加入PBS缓冲液500 μL，离心取上清备用。取上述病料或棉拭子样品上清约200 μL置1.5 mL离心管中，加入500~600 μL TRIzol剧烈振摇30 s后，静置5 min，再次剧烈振摇30 s后，静置5 min；加入200 μL氯仿，上下颠倒混匀30 s，静置5 min，4 ℃ 12 000 g离心15 min；离心完毕后，取上清400~500 μL（注意不要吸到中间层白色物质）放入新的灭菌离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒数次后（不可剧烈震动）静置10 min，4 ℃ 12 000 g离心10 min；倒掉异丙醇，加入1 mL 75%乙醇（DEPC水配制），振摇，将白色沉淀悬浮，4 ℃ 7 500 g离心5 min；弃去上清，将干燥沉淀物（将离心管倒置于卫生纸或者其他吸水纸上，室温约5 min即可）加入20 μL DEPC水溶解，用于RT-PCR检测，或-20 ℃保存备用；采用全自动核酸提取试剂盒提取RNA。RT-PCR检测根据NCBI上发表的IBV核酸全序列，设计扩增S1基因的特异性引物（表1），用于样品检测。引物由上海生工生物工程有限公司合成。RT-PCR反应条件（一步法试剂盒）：50 ℃ 30 min，95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸90 s，共32个循环；72 ℃延伸5 min。将RT-PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，使用凝胶成像仪观察并记录结果。
S1基因测序及分析将RT-PCR产物电泳后，对目的条带进行胶回收，回收产物与pMD18-T载体连接，连接产物转化至DH5α感受态细胞，然后将其涂在氨苄板上，置于37 ℃温箱内培养过夜；挑取单个白色菌落，接种到含有氨苄的LB液体培养基，37 ℃摇床培养8 h以上；对菌液进行RT-PCR检测，将阳性菌液送至生工基因公司进行测序。将测序结果拼接，采用MegAlign程序将检测序列与NCBI中发表的已知序列（表2）进行比对后进行基因型鉴定。
结果与分析
RT-PCR检测总体情况 利用RT-PCR方法，在采集的38 442份疑似样品中，检出6 436份IBV阳性样品，阳性检出率为16.7%，对其中2 983份阳性样本进行了S1基因测序分型（表3）。
时间分布 由表3可以看出，2019—2021年，IBV阳性检出率分别为12.5%、16.4%、21.0%，呈逐年增长趋势。按月份统计结果（表4）显示：1—12月份均有阳性样品被检出，阳性检出率呈现一定的季节性变化特征，7—9月份检出率（11.3%~15.4%）较低，3—6月（17.3%~19.3%）和10—12月（17.5%~19.0%）检出率较高。
地区分布 按照送检地区统计结果（表5）显示：全国29个省级行政区中有27个检出阳性样品，表明IBV的全国分布范围较广，且呈现一定的区域分布特征，东部和中部的家禽养殖密集区，如山东（19.5%）、河北（18.2%）、江苏（16.7%）、吉林（18.7%）、福建（23.7%）、甘肃（19.9%）、重庆（21.8%）等地区阳性检出率较高，西部和北部地区如内蒙古（3.6%）、新疆（2.0%）等地区阳性检出率较低。禽群分布不同品种 不同品种统计结果（表6）显示，IBV检出率存在一定的品种差异，白羽肉鸡阳性检出率最高（28.9%），肉种鸡最低（5.0%）。
不同周龄 不同周龄统计结果显示，各周龄阶段均有IBV感染，但0~6周龄阶段感染最为普遍和严重（表7），其中蛋鸡感染高峰为1~3周龄，而白羽肉鸡为2~6周龄（表8）。
S1基因测序及分析从6 436份阳性IBV样品中选取2 983份进行测序，然后用Meg Align软件进行序列比对，剔除774份已知疫苗株，将2 209份IBV野毒样本进行分型，按照年份、品种、周龄进行统计。基因型分布 统计结果（表9）显示：阳性样本中共检出5种基因型，其中QX型占比最高（66.5%），GVI型次之（27.7%），这两种为当前主要流行优势基因型。
不同基因型时间分布 统计结果（表10）显示，2019年QX型占比最高，达到72.4%，GVI型为19.6%。2021年QX占比仍然最高，但占比有所下降，为66.4%，而GVI型的占比却由19.6%提升至28.7%。从近3年的趋势来看，QX型呈下降趋势，GVI型有升高趋势。
不同基因型品种分布 统计结果（表11）显示，白羽肉鸡群中以QX型和GVI型为主，而其他鸡群中流行的基因型较为复杂，其中蛋鸡以QX、GVI、LDL型为主，黄羽鸡以QX型、GVI型、TW1型、重组型为主，肉种鸡以GVI型、QX型、重组型、LDL型为主。
不同基因型（QX和GVI）周龄分布 统计结果（表12）显示，QX型小日龄即可感染，0~3周龄检出占比为33.2%；GVI型在＞3~6周龄检出较多，占66.4%。6周龄以后QX型和GVI型检出占比均较低。
讨论
自1930年首次在美国北达科他州发现 IB 以来，几乎所有养鸡国家均发现有该病流行。我国于1978年由邝荣禄首次报道在广东省分离到IBV。IBV流行的基因型众多，且随着时间推移呈现复杂化趋势。本研究对我国29个省级行政区疑似IBV样品进行病原检测，结果发现IBV感染普遍，且呈加重趋势。目前疫苗免疫仍然是控制IB最常用、最有效的措施。目前常用的IBV活疫苗有Mass型（H120、H52、Ma5、w93、28/86）以及4/91、LDL、QX型等，其中Mass型+4/91型的组合已在国外众多国家使用，被认为对多种血清型的IBV毒株均能提供交叉保护。但近年来加拿大、美国等国家也开始出现“假母鸡”发病的报道，说明IB的现场流行情况比较复杂，对其防控面临更多的压力和挑战。国内目前采取H120+4/91或H120+LDT3或H120+QX等多种组合免疫方式，免疫效果良好。但大量的流行病学监测结果显示，国内流行的 IBV毒株正处于持续不断进化中。参考相关文献的IBV分类方法，从本次检测测序的基因型来看，QX型（66.5%）、GVI型（27.7%）占比较高，且GVI型流行有上升趋势，值得关注和警惕。当前针对GVI型的同源活疫苗还没有商业疫苗上市，因此对该基因型疫苗的研发应提上日程。针对IBV灭活疫苗，有学者认为其免疫后主要产生体液免疫IgG为主，对IB感染的引起的呼吸道类临床表现保护效果较差，但对于内脏型如肾型或生殖型临床保护良好。此外IBV灭活疫苗还具有安全性好、可快速应对变异株等优点，可作为防控IB的重要措施。此外，近年来从部分大型养殖企业的现场试用情况来看，保护效果超过预期。IBV致病与日龄具有相关性，感染日龄越小，危害越大。小日龄时，免疫系统尚不健全，一旦早期感染，可通过与α-2,3唾液酸受体结合，对呼吸道如气管、肺脏等上皮细胞损伤较大，引起气管纤毛大量脱落和炎性物质渗出，导致“支气管堵塞”现象。同时，部分基因型毒株如QX型、TW型、GVI型等经呼吸道感染后，可从单核细胞的病毒血症现象扩散至输卵管、肾脏、肠道等部位，引起“生殖型”“肾型”“腺胃型”等不同的发病现象。从本次研究结果来看，QX型初次感染高峰时间大多在3周龄以内，而GVI型初次感染高峰时间大多在3~6周龄阶段，品种以肉种鸡占比最高。关于不同基因型的日龄差异原因，目前尚不明确。分析认为可能与不同IBV毒株的生物学特性或母源抗体等因素有关。针对小日龄感染IBV的防控，一方面要加强生物安全，避免早期感染，对孵化室、育雏舍等进行定期的净场消毒；另一方面要减少饲养批次，避免不同日龄鸡群混养带来的带鸡传播。此外，还要对种鸡进行优势流行毒株如QX型、GVI型的针对性免疫，降低种鸡的带毒排毒概率，同时给下一代雏鸡提供高水平的母源抗体，降低生殖型IB患病风险。
结论
研究发现：我国IBV流行范围较大，发病率较高，且呈加重趋势；流行基因型复杂，但以QX 型和GVI 型为主；冬春或秋冬季节多发，小日龄鸡群感染严重，发病危害较大。因此，我国的IB防控面临较大压力与挑战，需要加强优势基因型疫苗的研发，重点做好小日龄鸡群的IB防控。
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