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摘要：为查明湖南省郴州市黄牛弓形虫感染情况并探讨其可能的风险因素，应用间接血凝试验（IHA）检测该地区9个牛场710份黄牛血清样品中的弓形虫抗体，使用统计学方法计算黄牛弓形虫血清阳性率，使用SPSS V23.0软件，对不同风险因素的弓形虫感染情况进行卡方检验。结果显示：受检黄牛血清样本中检出弓形虫抗体阳性共64份，抗体阳性率为9.0%；所有被检牛场均存在感染，其中资兴市牛场抗体阳性率（14.5%）最高；春季（12.9%）和夏季（13.7%）的弓形虫抗体阳性率高于秋季（5.1%）和冬季（4.1%），差异显著（P＜0.05）；规模牛场的弓形虫抗体阳性率与散养牛场弓形虫抗体阳性率分别为8.9%和9.1%，差异不显著（P＞0.05）；卫生状况差的牛场弓形虫抗体阳性率（12.9%）高于卫生状况好的牛场（7.4%），差异明显（P＜0.05）；母黄牛弓形虫抗体阳性率（9.1%）略高于公黄牛（8.6%），差异不明显（P＞0.05）；所有年龄段黄牛均可感染弓形虫，其中3岁以上黄牛的弓形虫抗体阳性率最高（14.8%），而3岁以下的黄牛弓形虫抗体阳性率为7.8%~9.7%，差异不显著（P＞0.05）；有猫存在的牛场弓形虫抗体阳性率为12.8%，而没有猫的牛场弓形虫抗体阳性率为2.9%，差异显著（P＜0.05）。郴州市北部牛场感染弓形虫的风险约是西部的8.4倍，南部约是西部的8.6倍，中部约是西部的4.6倍；有猫存在的牛场感染弓形虫的风险是没有猫的4.8倍；黄牛在夏季感染弓形虫的风险约是在冬季的3.7倍，卫生状况差的牛场黄牛感染弓形虫的风险约是卫生状况好的1.9倍。结果表明：郴州市黄牛养殖场弓形虫感染普遍，而牛场地理位置、猫的存在、季节和牛场卫生状况是黄牛弓形虫感染的主要风险因素，故应根据主要风险因素制定相应的防控措施，做好牛弓形虫病防控，以确保人类安全。
弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种世界范围内广泛分布的机会性病原虫，可寄生于除红细胞外的所有有核细胞，可自然感染人类以及犬、猫、猪、牛、羊、鸡等温血动物，其终末宿主是猫等猫科动物。由弓形虫感染引起的弓形虫病是一种人兽共患病，被世界动物卫生组织（WOAH）列为须报告动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。弓形虫病在免疫力正常的人群中不表现明显的临床症状，但对免疫力低下人群损害极大，严重者甚至死亡。家畜感染弓形虫后，可出现流产等繁殖障碍症状，对养殖业造成重大经济损失，且能通过其肉、奶制品等直接或间接地传染给人而威胁人类健康。
我国是全球牛肉的主要消费市场，2019年牛肉消费量为840万t。人类感染弓形虫主要通过摄入生的或未煮熟的食物，包括肉类。初步调查表明，湖南省黄牛弓形虫抗体阳性率高达24.5%。湖南省黄牛养殖逐渐兴盛，而郴州市拥有湖南省主要的黄牛养殖基地，但是关于郴州市黄牛弓形虫感染情况未见报道。因此，监测该地区黄牛弓形虫流行情况并分析影响其感染的风险因素具有重要公共卫生意义。
材料和方法
采样策略和样本来源
根据《湖南省动物疫病监测与流行病学调查计划》，结合随机取样原则，分别从郴州市的东部（汝城县）、西部（嘉禾县）、南部（宜章县）、北部（安仁县）和中部（苏仙区和资兴市）地区的牛场采样。经调查全国肉牛饲养规模记录数据，这6个地区共有规模化牛场（150头≤存栏数＜2 000 头）4个（苏仙区1个、汝城县1个、资兴市1个、安仁县1个），散养牛场（30头≤存栏数＜149 头）93个（苏仙区27个、宜章县6个、嘉禾县7个、安仁县4个、资兴市49个）。本次研究样品来自9个牛场，其中规模场4个、散养场5个（每个地区各取1个）。对存栏量大于150头的规模场，按照5%的比例采样，对散养场则全群采样。2018年秋季、冬季以及2019年春季、夏季，共通过颈静脉采集黄牛血液样本710份。
样本处理
将血液样本置于普通一次性塑料管中，经4 000×g离心10 min后得到血清，将血清转入新的离心管中并保存在-20 ℃直至使用。
主要试剂
弓形虫 IHA 抗原、标准阴性血清、标准阳性血清（效价≥1:1 024）和稀释液，均购自中国农业科学院兰州兽医研究所。
方法
间接血凝试验（IHA） 按照相关文献和《弓形虫病诊断技术》（NY/T 573—2002）进行检测。先在反应板每孔滴加0.075 mL血清，然后在第一孔滴加0.025 mL样品，随后以4倍递呈稀释3孔，最后一孔弃去0.025 mL，盖上玻璃板，使用微型振荡器振荡2 min。完成上述步骤后，放入37 ℃恒温箱中2 h后观察结果。每板设阴、阳性及空白对照各2孔。被检血清1:16稀释孔内，呈现“澄清”以上凝集者判为阳性，若有可疑孔，则需复检。
数据分析 用Excel 2016软件整理收集到的数据，并计算黄牛弓形虫血清抗体阳性率及其95%置信区间（95%CI）。采用SPSS V23.0（IBM，Chicago，IL）软件，对不同变量（牧群规模、卫生状况、地区、季节、黄牛性别、黄牛年龄以及养殖场是否有猫）的弓形虫感染情况进行多元逻辑回归分析，当P＜0.05时认为差异有统计学意义。本调查还分析了基于似然比统计的优势比（OR）及其95%CI。
结果与分析
总体情况
在采集的710份黄牛血清样品中，检测出弓形虫抗体阳性64份，平均抗体阳性率为9.0%（表1）。所有被检牛场均存在感染，场群抗体阳性率为100%。
三间分布及风险因素
2018年秋至2019年夏，郴州市各县区黄牛弓形虫抗体阳性率及相关风险因素分析结果见表2。
地区分布 不同地区黄牛弓形虫抗体阳性率分析结果显示：南部和北部牛场黄牛弓形虫抗体阳性率较高，分别为12.9%和12.7%，东部和中部较低，阳性率分别为9.4%和7.4%，而西部最低，仅为1.7%。
季节分布 在不同的季节分组中，春季（12.9%）和夏季（13.7%）黄牛弓形虫抗体阳性率较高，而秋季和冬季的阳性率明显低于这两个季节，分别为5.1%和4.1%（P＜0.05）。
群间分布 规模牛场的抗体阳性率与散养牛场没有明显差异（P＞0.05），分别为8.9%和9.1%；卫生状况差的牛场抗体阳性率（12.9%）明显高于卫生状况好的牛场（7.4%，P＜0.05）；母黄牛弓形虫抗体阳性率为9.1%，略高于公黄牛（8.6%），但差异不显著（P＞0.05）；不同年龄段的黄牛均可感染，其中3岁以上黄牛的弓形虫抗体阳性率最高，为14.8%，而1岁以下、1~2岁和2~3岁年龄段的黄牛弓形虫抗体阳性率分别为7.8%、8.1%、9.7%，但差异没有统计学意义（P＞0.05）；有猫存在的牛场弓形虫抗体阳性率为12.8%，而没有猫存在的为2.9%，差异显著（P＜0.05）。
风险因素 基于上述三间分布结果，认为黄牛养殖的地理区域、季节以及养殖场中猫的存在和卫生状况是影响郴州市黄牛弓形虫感染的4个主要风险因素。郴州市北部牛场感染弓形虫的风险约是西部的8.4倍，南部约是西部的8.6倍，中部约是西部的4.6倍；有猫存在的牛场感染弓形虫的风险是没有猫的4.8倍；黄牛在夏季感染弓形虫的风险约是在冬季的3.7倍，卫生状况差的牛场黄牛感染弓形虫的风险约是卫生状况好的1.9倍（表2）。
讨论
总体情况
本调查结果显示，郴州市黄牛弓形虫抗体阳性率为9.0%，与近十年来国内牛弓形虫血清总阳性率（10.1%）相近，但相比于21世纪初湖南省黄牛弓形虫抗体阳性率（24.5%）有明显降低，这可能与2012—2020年采取的疫病控制措施有关。本研究结果比 2018年重庆市部分地区牛弓形虫抗体阳性率（27.25%）、2017年云南省临沧市牛弓形虫抗体阳性率（14%）都要低，但比2019年延边市黄牛弓形虫抗体阳性率（5.0%），2018年河南省牛弓形虫抗体阳性率（1.93%），2019年青海省互助加定镇牛弓形虫抗体阳性率（0）和内蒙古自治区部分地区牛弓形虫抗体阳性率（0）要高。这些差异可能与地理区域、气候环境和饲养管理有关。
影响因素
地理区域 根据本调查的分析结果可知，地理区域是黄牛感染弓形虫的最主要风险因素，其原因可能与不同区域的水流域有关。之前的研究表明，弓形虫卵囊可以通过淡水径流进入海洋，从而对居住在河流、湖泊附近的人类和其他动物构成威胁，而资兴市为此次调查中黄牛弓形虫血清阳性率最高的地区，其境内有东江湖等湖泊流域，增加了黄牛在饮水时感染弓形虫的风险。
养殖场有无猫 本次调查结果表明，猫的存在是影响黄牛感染弓形虫的重要风险因素之一。调查发现有猫存在的养殖场弓形虫阳性率大大高于没有猫的养殖场，这与之前的研究结果一致。猫科动物作为弓形虫的终末宿主，是唯一可以用卵囊污染环境的动物。这些卵囊对环境因素具有高度的抗性，可以在潮湿的环境中产生孢子并存活数月。养殖场的猫和黄牛经常近距离接触，甚至同饮水，持续接触猫粪便中排泄的卵囊会增加感染的风险。有猫的养殖场弓形虫血清阳性率较高，这提示应重视猫科动物污染环境的风险。
季节因素 本调查结果显示，季节因素也是黄牛感染弓形虫的风险因素之一。其中黄牛在春夏两季弓形虫抗体阳性率最高，明显高于秋冬两季，这可能与春夏的温度和湿度高有关。弓形虫的感染在温暖潮湿地区比寒冷干燥地区更普遍。作为牛饲料的新鲜牧草可能是弓形虫卵囊的温床，而潮湿的环境有利于卵囊的存活。本调查的结果与以往的报道一致。但也有研究表明，季节并不是弓形虫感染的风险因素。
卫生因素 本次调查结果显示，卫生因素也能影响黄牛感染弓形虫，卫生状况好的牛场弓形虫阳性率明显低于卫生状况差的牛场。不规范管理的养殖场导致黄牛饮用水质差、饲料不新鲜等一系列问题，都有可能增加黄牛感染弓形虫的风险。
畜群规模 调查结果显示，规模牛场的抗体阳性率与散养牛场没有明显差异，分别为8.9%和9.1%，经分析后可知，群规模并不是影响郴州市黄牛感染弓形虫的风险因素，造成该结果的原因尚不清楚，但是样本量的差异可能对结果造成一定的影响。要弄清此原因，还需要进行更加深入的研究。
性别和年龄 母牛血清阳性率（9.1%）略高于公牛（8.9%），这与之前的报道一致。不同年龄阶段的黄牛弓形虫抗体阳性率也没有显著差异，说明性别和年龄不是影响黄牛弓形虫阳性率的风险因素。其原因可能是，任何年龄段的黄牛都有机会接触到被弓形虫卵囊污染的食物而受感染，再加上黄牛是放牧动物，其生活的范围广阔，更增加了被感染的概率。
采样及检测方法的局限性
本次调查在采样过程中遵循随机采样原则，但由于特殊原因，个别区县的养殖场不同意采样，故采样范围未覆盖到整个郴州市区县不同规模的养殖场。其次，本试验也存在分组中样本数量不均衡等问题，这些都有可能对检测结果造成一定影响。
IHA法是一种高特异性、成本低且容易操作的弓形虫检测方法，主要检测弓形虫的IgG和IgM抗体。IHA比弓形虫改良凝集试验（MAT）和酶联免疫吸附试验（ELISA）有更高的特异性，且因为ELISA试剂盒价格昂贵，MAT法抗原诊断液制备较为复杂，所以IHA法被广泛应用于多种动物的弓形虫流行病学研究。但不可否认，IHA的敏感性低于MAT和ELISA，所以本研究结果可能存在一些误差。
结论
本调查表明：湖南郴州市黄牛弓形虫感染较为普遍，所有被调查的牛场均存在一定程度的感染；牛场的地理位置、猫的存在、季节和牛场卫生状况是郴州市黄牛感染弓形虫的主要风险因素。因此，郴州市需要根据主要风险因素制定相应的防控措施，做好牛弓形虫病防控，降低对人类的潜在危害。
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