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摘要：为了解四川省兔出血症病毒2型（rabbit hemorrhagic disease virus type 2，RHDV2）的流行情况及分子遗传变异特征，采集全省范围内的7 525份样品，其中发病兔场肝脏组织样品117份、环境拭子样品243份，受监测兔场血液样品3 340份、环境拭子样品3 825份，采用商品化荧光RT-PCR试剂盒，对以上样品进行RHDV2检测；对筛选出的12份肝组织阳性样品进行RHDV2 VP60基因RT-PCR扩增、测序和遗传进化分析。结果显示：RHDV2流行无明显季节性，各养殖品系家兔均有RHDV2感染，哺乳仔兔、幼兔、怀孕哺乳母兔死亡率分别为25%~60%、18%~45%、9%~30%。发病兔场肝脏样品RHDV2阳性检出率为88.89%（104/117），环境样品为46.09%（112/243）；受监测兔场全血样品RHDV2阳性检出率为25.99%（868/3340），环境样品为16.29%（623/3825）。12份阳性样品的RHDV2 VP60基因序列长度均为1 740 bp，核苷酸序列同源性为98.4%~100%，在系统发生进化树上独成一簇；与国内外参照毒株的VP60基因序列核苷酸同源性为93.7%~100%，编码的氨基酸序列同源性为95.7%~99.8%。结果表明：RHDV2已开始在四川省流行，需要加强检疫，重视饲养管理工作；其VP60基因序列出现了一定程度的变异，但遗传演化相对稳定。本研究补充了国内RHDV2的分子流行病学信息，也为该病的相关防控研究和控制对策制定提供了参考。
兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease，RHD）俗称兔瘟，是兔的一种急性、高度致死性传染病。RHD因潜伏期短、发病急、病程短、传播快、死亡率高（可达100%），被我国列为二类动物疫病。该病典型病变特征是呼吸系统出血，实质器官淤血、肿大、出血，肝脏坏死，由嵌杯病毒科（Caliciviridae）兔病毒属（Lagovirus）兔出血症病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）感染引起。根据感染的RHDV基因型不同（RHDV GI.1~4），RHD可分为RHD1型（经典型）和RHD2型两种。其中，RHD1型曾在世界很多国家发生和流行，但随着免疫接种等防控措施的实施，RHD1的流行得到基本控制。RHD2型由RHDV GI.2基因型毒株（以下称RHDV2）感染引起，2010年由法国首次报道。2020年以前，RHD2主要在欧洲一些国家发生，之后出现在非洲国家以及美洲的美国和墨西哥，呈现蔓延趋势。2020年4月我国四川省金堂县首次发生RHD2疫情，平均死亡率为42.85%，共扑杀销毁家兔3 500余只，给养殖户带来较大经济损失。国内目前没有预防RHD2的疫苗，也无有效的治疗药物可用，因而该病严重威胁着养兔业健康发展。
为了解四川省RHDV2的流行情况、分子流行病学特征和遗传变异规律，本研究于2020—2021年对四川省兔场进行了流行病学调查，采用荧光RT-PCR方法，对发病兔场的360份样品（117份病死兔肝脏组织样品、243份兔场环境拭子样品）和705个受监测兔场的7 165份样品（3 340份全血样品及3 825份环境拭子样品）进行了RHDV2核酸检测，筛选出12份来自不同地区发病兔场的病原核酸阳性样品；设计合成2对RHDV2 VP60基因特异性引物，通过常规分子生物学技术，对12份RHDV2核酸阳性样品进行了VP60基因扩增测序和遗传变异分析，以期为有效控制RHD2型疫情在四川省的蔓延及其控制对策制定提供参考。
材料与方法
毒株、菌种及试剂
2×Taq PCR Master mix、琼脂粉和TIANgel Midi Purification Kit（DP209）等，购自成都安雅生物试剂有限公司；DL 2 000 DNA Marker，购自成都大连宝生物科技有限公司；病毒DNA/RNA提取试剂盒（4.0），购自西安天隆科技有限公司；RHD2型荧光RT-PCR检测试剂盒，购自四川博策检测技术有限公司；EVO M-MLV反转录试剂预混液试剂盒，购自湖南艾科瑞生物工程有限公司。
样品来源
受检样品共计7 525份。其中：360份来自发病兔场，包括117份病死兔肝脏组织样品和243份发病兔场环境拭子样品，采自12个地市18个县区25个发病兔场（表1）；7 165份血液及环境拭子样品，采自受监测的705个规模兔场，包括2020年在全省所有地市432个集中监测规模兔场采集的全血样品2 080份、兔场环境样品2 345份，2021年在全省12个地市273个集中监测规模兔场采集的全血样品1 260份、兔场环境样品1 480份。
样品采集
肝脏组织样品：对病死兔解剖，无菌采集肝脏组织，-20 ℃冻存备用；环境棉拭子：采集兔养殖场地面、圈舍、食槽、排泄物等环境样品，置于PBS缓冲液中，-20 ℃冻存备用。受监测兔场采样原则：存栏500只及以上的规模兔场，每个兔场至少采集10份全血样品和10份环境样品；500只以下的兔场，采集5份全血样品和5份环境样品。以上样品均由四川省动物疫病预防控制中心收集保存。
发病兔场流行病学调查
统计发病兔场发病时间、地点、家兔品系、存栏量、死亡率等基本信息，分析RHD2的发生与季节、品系等的相关性，统计不同生长阶段兔只的死亡率。
荧光RT-PCR检测
将肝脏组织样品研磨匀浆，离心取上清，将环境拭子样品离心取上清，将全血样品直接取样，按常规方法进行总RNA提取，使用RHD2型荧光RT-PCR检测试剂盒进行检测。
VP60基因扩增及测序
根据GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中的RHDV2基因组序列，通过DNAstar和Premier 5.0软件分析后，针对VP60基因片段设计2对特异性引物（表1）。引物由成都擎科生物有限公司合成，按照合成说明书将其稀释至10 μmol/L，-20 ℃冻存备用。
将经荧光RT-PCR检测筛选出的12份来自不同地区发病兔场的RHDV2核酸阳性肝组织样品，提取总RNA，根据EVO M-MLV反转录试剂预混液试剂盒说明书进行反转录操作，以反转录产物（cDNA）为模板，分别以P1/P2、P3/P4为引物，进行RHDV2 VP60两段基因的PCR扩增，反应结束后取5 μL产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。纯化回收PCR产物，由成都擎科生物有限公司进行序列测定，用DNAstar软件拼接后进行测序结果的Blast分析。
VP60基因序列分析
使用DNAstar等软件分析扩增测序的RHDV2 VP60基因序列的结构组成特征，收集GenBank中的国内外14条不同基因型的RHDV VP60基因序列和10条RHDV2 VP60序列进行RHDV2 VP60基因的核苷酸及其编码氨基酸的同源性分析，同时绘制VP60基因序列系统进化树进行遗传变异分析。
结果与分析
发病兔场流行病学调查
经过对发病兔场的流行病学调查可知：RHD2流行无明显季节性；伊拉配套系、新西兰兔、伊普吕配套系、伊高乐配套系等多个品系家兔均有发病；哺乳仔兔死亡率为25%~60%，部分呈现整窝死亡，幼兔死亡率为18%~45%，怀孕哺乳母兔死亡率为9%~30%。具体情况见表2。
荧光PCR检测
发病兔场 2020—2021年，累计检测发病兔场117份肝脏组织样品及243份环境样品，检出肝脏组织阳性样品104份，阳性检出率为88.89%，检出兔场环境阳性样品112份，阳性检出率为46.09%。部分RHDV2荧光RT-PCR检测结果见图1。
受监测兔场 2020年共检测全血样品2 080份，阳性检出率为14.18%，检测环境样品2 345份，阳性检出率为10.28%；涉及规模场432个，场点阳性检出率为8.56%，2021年共检测全血样品1 260份，阳性检出率为45.48%，检测环境样品1 480份，阳性检出率25.81%；涉及规模场273个，场点阳性检出率为39.93%。全血样品总体阳性检出率为25.99%（868/3 340），环境样品总阳性检出率为16.29%（623/3 825）。具体统计结果见表3。
VP60基因RT-PCR检测
分别以P1/P2、P3/P4为引物，对抽提的12份RHDV2阳性病料中的VP60基因不同片段进行RT-PCR扩增，结果如图2-A和图2-B所示。每份RHDV2都扩增出约1 095 bp和1 117 bp预期大小的两条特异性DNA条带（即VP60a和VP60b片段），阴性对照样品无扩增。
VP60基因测序鉴定
分别对12份RHDV2阳性样品的VP60基因不同片段进行纯化回收及序列测定，将测序结果拼接后进行Blast分析。结果显示，12条扩增序列与GenBank中RHDV2毒株的同源性均在97%以上，表明成功扩增出了12份阳性样品的RHDV2 VP60基因序列。通过DNAstar软件进行VP60编码框（ORF）序列整理，分别编号为SCh202001—SCh202012。
VP60基因序列特征
采用DNAstar生物学信息软件MegAlign程序进行12份阳性样品的RHDV2 VP60基因序列特征分析，结果受检的12份阳性样品的RHDV2 VP60基因序列长均为1 740 bp，编码579个氨基酸。12份阳性样品的RHDV2 VP60基因序列在第18、24、99、105、114、132、213、252、321、330、363、378、399、568、612、705、723、741、765、804、828、882、885、930、1 026、1 056、1 089、1 095、1 155、1 156、1 165、1 227、1 231、1 242、1 284、1 317、1 551、1 576、1 608、1 618和1 622 bp共41处核苷酸存在突变，核苷酸序列同源性为98.4%~100%，其中114、1 156、1 165、1 231、1 576、1 618和1 622 bp 等7处为错义突变，其他34处均为同义突变，且SCh202004和SCh202005、SCh202007和SCh202009同源性为100%，表明12份阳性样品的RHDV2 VP60基因遗传相对稳定。
VP60基因同源性分析
通过DNAstar软件与GenBank中的10条RHDV2毒株VP60参考序列（表2）进行同源性分析，发现22条VP60基因序列核苷酸同源性为93.7%~100%，其中Sch202010与2020年新加坡RHDV2分离株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）同源性最低（93.7%）；推导的对应氨基酸序列同源性为95.7%~99.8%，其中SCh202002、SCh202003、SCh202004、SCh202005和SCh202006与2010年法国RHDV2分离株10-32（HE800532）同源性最低（95.7%），而Sch202010与2020年新加坡RHDV2 分离株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）推导氨基酸同源性最低（97.2%）。结果表明，12份阳性样品的RHDV2 VP60基因与国外早期和最近毒株相比出现了一定程度变异，但仍相对稳定。
VP60基因遗传演化分析
通过DNAstar软件对12份阳性样品的RHDV2 VP60基因序列与国内外14条不同基因型的RHDV VP60序列和10条RHDV2 VP60序列进行核苷酸比较，绘制系统发生进化树（图3）。经典型RHD毒株（GI.1毒株）和RHDV2毒株形成两个大分支：参考的经典型RHD毒株又分为2个分支，国内的经典型RHD株分别处在不同分支；RHDV2毒株也可分为2个分支，12份阳性样品的RHDV2 VP60序列和我国2020年RHDV2 SC2020-04株（MT383749）单独成簇，与Sweden 2018年分离株2381（MH341513）在一个分支，与新加坡RHDV2分离株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）处于不同分支。结果表明，RHDV2毒株VP60基因序列遗传演化可能会呈现复杂化趋势，目前仍相对稳定。
讨论
2010年法国报道出现RHD2后，意大利、西班牙、德国、葡萄牙、英国、挪威等多数西欧国家和亚速尔群岛，以及北非和南非一些国家陆续报道了该病的发生，2019—2020年美国、墨西哥、日本、中国和菲律宾报道发生该亚型疫情，RHD2疫情流行速度快，暴发范围广，呈现出替代经典型RHD（RHD1）趋势。
本研究通过流行病学调查发现，RHD2流行无明显季节性，常见的品系家兔均有发病，其中伊拉配套系发病死亡率较高，乳兔和幼兔死亡率高于成兔，这与国外相关报道一致。样品检测结果显示，发病兔场和受监测兔场的环境样品阳性率在16.29%以上，提示RHDV2传播潜力强大，加强饲养管理和做好消毒等的日常预防具有重要意义。
据相关报道，我国首次发生RHD2疫情的两个兔场的RHDV2 VP60基因片段核苷酸同源性为99.1%，与RHDV2参考毒株的同源性为94.1%~98.3%，属于同一分支上，与经典型RHD毒株的同源性为79.0%~80.0%，亲缘关系较远。为进一步了解其分子流行特点，本研究对12份阳性样品的RHDV2 VP60基因全序列进行了克隆分析。作为RHDV的主要结构蛋白，VP60蛋白的氨基酸序列可分为A（1~21）、B（22~300）、C（301~328）、D（329~343）、E（344~434）和F（435~580）6个区，通过折叠成内壳（S-shell区）和外壳（P2区）两个主要的紧凑区域构成衣壳，其中N端的A和B区组成内壳区，C端的C、D、E、F区组成外壳区，分别位于N端第3l~250位和C端第477~579位氨基酸之间的主要抗原区域。本研究表明，受试的12份RHDV2 VP60基因核苷酸序列有41处突变，含34处同义突变和7处错义突变，即VP60蛋白的B（22~300）1处、E（344~434）2处和F（435~580）3处错义突变。这一点与金明兰等研究RHDVYL毒株VP60基因遗传演变分析时得出的VP60蛋白A、B、D、F区变异相对较低、C、E区变异较高的结论存在一定差异，这需要在更多RHDV2 VP60序列的变异分析上进一步验证，当然这也可能是RHDV2毒株遗传变异的特点。虽然目前12份RHDV2 VP60基因的遗传演变相对稳定，但仍需要警惕较大变异幅度的毒株出现。
通过DNAstar软件对12份阳性样品的RHDV2 VP60基因序列与国内外14条不同基因型的RHDV VP60序列和10条RHDV2 VP60序列绘制系统发生进化树，发现12份RHDV2 VP60序列和我国2020年RHDV2 SC2020-04株（MT383749）单独成簇，与Sweden 2018年分离株2381（MH341513）参考序列同源性较高；RHDV2毒株VP60序列同源性分析发现，RHDV2 VP60基因序列核苷酸同源性为93.7%~100%，其中Sch202010与国外毒株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）同源性最低（93.7%），但是12份阳性样品的RHDV2 VP60核苷酸序列同源性为98.4%~100%，这都表明12份阳性样品的RHDV2 VP60基因与国外早期和最近毒株相比出现了一定程度变异，但遗传相对稳定，同时也提示目前我国RHDV2毒株VP60基因比较保守且可能存在区域性特点。需要注意的是，本研究克隆分析用的RHDV2毒株均为同一时期的毒株，通过系统发生进化树发现，国内RHDV毒株流行时期不同，分支也不同，提示RHDV2毒株在我国很可能随着时间和地区的改变出现新的变异现象。
本研究对四川全省1年多时间的RHDV2流行情况进行调查和统计分析，对RHDV2基因序列信息进行收集比对，对12份RHDV2 VP60基因进行了克隆测序和遗传变异分析，发现RHDV2已经在四川省多个地市存在，其VP60基因序列出现了一定程度的变异，但遗传演化相对稳定，RHDV2毒株单独成簇。本研究补充了国内RHDV2的分子流行病学信息，也为RHD2相关防控研究和控制对策制定提供了参考。
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