|
摘要：为了解我国猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）的流行及遗传变异情况，2020年对来自7个省的570份疑似PRRSV感染样品进行RT-PCR检测，并对60个PRRSV阳性样品进行ORF5基因测序及分析比较。RT-PCR检测结果显示，2020年送检样品中，PRRSV阳性检出率为23.68%（135/570），其中保育猪病料的阳性检出率最高，为32.24%（108/335）。同源性对比及遗传进化分析结果显示，60个PRRSV均为PRRSV2（美洲株），主要属于谱系1和谱系8，占比分别为51.67%和43.33%。氨基酸分析结果显示，60个PRRSV的GP5蛋白氨基酸以点突变为主，其中10个PRRSV的GP5蛋白氨基酸出现缺失突变，且非中和表位、中和表位、潜在毒力位点及Ｎ-糖基化位点均发生不同程度的变异。结果表明，保育猪群为PRRSV高发病群体，谱系1 PRRSV或已成为国内流行优势毒株，且PRRSV不断发生变异，这或许会影响现有疫苗的免疫保护效果。因此，针对PRRS需要综合防控，除选用安全有效的PRRSV弱毒活疫苗进行免疫外，加强猪场生物安全及饲养管理也极其重要。
猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）可引发猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗称“蓝耳病”。PRRS是一种高度接触性传染病，导致猪群出现繁殖障碍、免疫抑制及呼吸道疾病等问题，引发猪只死淘率增高，对猪场生产造成严重影响。PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组大小15 kb左右，含开放阅读框（open reading frame，ORF）至少11个，编码结构蛋白8种，非结构蛋白至少16种。
PRRSV可分为两大亚群，分别为PRRSV1（欧洲株）和PRRSV2（美洲株）。据ORF5基因序列分析，PRRSV2可分为9个谱系，其中在我国流行的主要分布在4个谱系，分别为谱系1（代表毒株为NADC30及MN184B）、谱系3（代表毒株为GM2）、谱系5（代表毒株为VR2332）及谱系8（代表毒株为CH-1a、BJ0706及JXA1）。2012年前，在我国流行的PRRSV毒株为经典美洲株（代表毒株CH-1a）和高致病性毒株（HP-PRRSV，代表毒株JXA1），其中2006年以后HP-PRRSV为主要流行毒株，其致病力比经典PRRSV明显增强。2012年NADC30-like PRRSV被报道。该类毒株易重组，彼此间同源性低，且临床致病性具有明显差异。2017年后，我国多省发现NADC34-like PRRSV。当前，我国主要流行毒株已逐渐由HP-PRRSV转为NADC30-like PRRSV。NADC30-like PRRSV毒株与美国1-7-4分支毒株相似，而1-7-4分支毒株已对美国及秘鲁的养猪业造成重大影响。2020年美国报道一种美洲型HP-PRRSV毒株，被命名为ORF5 1-4-4 Lineage 1C变异株（简写为PRRSV 1-4-4）。该毒株传播力强，致死率高，已严重影响美国养猪业。NADC30-like PRRSV、NADC34-like PRRSV及PRRSV 1-4-4均为PRRSV2（美洲株），且属于谱系1。
本试验收集2020年我国部分地区PRRSV感染临床可疑样品，通过ORF5基因测序比对分析，了解国内PRRS的分子流行病学变化情况，旨为PRRS防控提供依据。
材料与方法
病料收集处理
2020年从山东、河北、江苏、安徽等7个省，采集570份疑似PRRSV感染的病料（胎衣和组织）、血液（全血和脐带血）及精液，经实验室处理后，按照相关文献的RT-PCR方法进行抗原检测。
检测用ORF5基因引物如下：
上游：CATTTCATGACACCTGAGACCA；下游：AGAGCATATATCATCACTGGCG。
RT-PCR扩增条件如下：
94 ℃预变性2 min；94 ℃变性15 s，54 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，32个循环；68 ℃延伸10 min。
主要试剂
RNA提取试剂盒，购于TAKARA公司；高保真反转录试剂盒，购于罗氏公司；LA Taq DNA聚合酶，购于宝生物工程（大连）有限公司。
PRRSV GP5测序
将PRRSV RT-PCR阳性产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。
核苷酸进化分析
通过软件DNAstar Lasergene，对送检测序PRRSV ORF5基因进行序列同源性比对分析；利用MEGA 6.0软件，对ORF5基因序列进行遗传进化分析。
氨基酸进化分析
通过软件DNAstar Lasergene，对送检测序PRRSV GP5蛋白氨基酸位点进行分析，并基于ORF5基因编码序列，通过NetNGlyc l.0 Sever在线软件（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/），预测并分析相应氨基酸序列的糖基化位点。
结果与分析
RT-PCR检测
将2020年采集的570份疑似PRRSV感染病料进行RT-PCR检测，目的条带大小为603 bp。结果（图1、表1）显示：从送检的疑似PRRSV感染病料中检出PRRSV病原阳性135份，阳性检出率为23.68%，其中保育猪病料的阳性检出率最高，为32.24%，哺乳猪次之，为19.09%。
ORF5基因同源性比对分析
随机送检60份PRRSV阳性样品的PCR产物进行ORF5基因测序，经比对后确认得到60个603 bp的ORF5基因序列。将这60个ORF5基因序列按照“送检年月-样品编号-送检省份缩写”进行编号。基因序列对应省份及数量分布见表2。60个ORF5基因序列与不同谱系标准毒株序列通过DNAstar软件的比对结果（表3、图2）显示，60个ORF5基因序列彼此间同源性为79.9%~100%，与国内流行的PRRSV2 4个谱系标准毒株同源性为81.3~99.7%，与PRRSV1标准毒株同源性仅为60.7%~63.8%，表明这60个PRRSV毒株均为PRRSV2。
ORF5基因遗传进化分析
60个PRRSV的ORF5基因序列通过MEGA 6.0软件绘制遗传进化树。结果（图3）显示，31个PRRSV属于谱系1，占比达51.67%，26个属于谱系8，占比达43.33%。此外，1个PRRSV属于谱系3，1个属于谱系5，而剩余1个（20200624-262-JS）介于谱系5和谱系8（可能为疑似PRRSV重组毒株，有待进一步研究），占比均为1.67%。
GP5蛋白氨基酸位点变异分析
将60个PRRSV GP5蛋白氨基酸序列通过DNAstar软件与相应谱系的标准毒株进行比对。结果（图4）显示，60个PRRSV GP5蛋白氨基酸以点突变为主，其中10个PRRSV分别在33 aa或34 aa处存在缺失突变；信号肽区域（1~25 aa）以及27~39、57~61、120~125、167~170及189~196 aa等6个区域的氨基酸点突变集中程度较高。
60个PRRSV GP5蛋白的2个非中和表位（27~30和180~197 aa）、1个中和表位（37~45 aa）及2个潜在毒力位点（R13和R151）氨基酸变化及相应谱系占比详见表4。从表4可知：60个PRRSV在非中和表位（180~197 aa）突变比例最高，平均为96.67%；其次为R13潜在毒力位点，突变比例平均为53.33%；非中和表位（27~30 aa）突变比例最低，平均为35.00%；而中和表位及R151潜在毒力位点也发生不同程度突变，平均分别为51.67%和48.33%。
GP5蛋白潜在N-糖基化位点变异分析
通过NetNGlyc l.0 Sever在线软件，对60个PRRSV GP5蛋白氨基酸序列的N-糖基化位点进行预测分析。结果（表5）显示，谱系1参考毒株NADC30、PRRSV 1-4-4和NADC34潜在糖基化位点数量分别为3、4和5个，而潜在糖基化位点数量为4个的样品占比最高，为48.39%（15/31）；谱系3、谱系5参考毒株与其相应样品PRRSV潜在糖基化位点数量一致；20200624-262-JS潜在糖基化位点数量为3个；谱系8参考毒株CH-1a和JXA1潜在糖基化位点数量分别为3和4个，潜在糖基化位点数量为4个的样品占比最高，为73.08%（19/26）。60个PRRSV的潜在N-糖基化位点位置主要集中在34~35、43~44和50~51 aa，占比分别为65.00%（39/60）、96.67%（58/60）和100%（60/60）。
讨论
PRRS是猪场防控的重要猪病。我国猪群PRRSV感染较普遍，田间流行毒株复杂多样。从PRRSV的RT-PCR抗原检测结果可知，疑似发病场的PRRSV阳性检出率为23.68%，其中保育猪群最高（32.24%），这与猪场临床发病情况相符，主要与保育阶段猪只免疫力低、应激因素多以及环境因素等直接相关。
通过60个PRRSV的ORF5基因同源性比对结果可知，不同PRRSV毒株间同源性差异较大，谱系1中PRRSV与NADC30、NADC34及PRRSV 1-4-4的同源性为87.1%~97.7%，与其他谱系参考毒株同源性＜88.2%；谱系8中PRRSV与JXA1、HuN4及TJ PRRSV的同源性为97.2%~99.7%，与其他谱系参考毒株同源性＜89.1%。由此可知，不同谱系PRRSV的ORF5基因同源性较低，而PRRSV同源性高低对PRRSV疫苗保护效果产生影响。
通过进化树结果分析发现：59个PRRSV分别属于谱系1、谱系3、谱系5和谱系8，剩余1个介于谱系5与谱系8；谱系1占比最高，为51.67%，其中30个为NADC30-like PRRSV，仅1个河北样品为NADC34-like PRRSV，未发现PRRSV 1-4-4及MN184B PRRSV。结果表明，国内流行的PRRSV毒株复杂多样，但以NADC30-like PRRSV为主流流行毒株。该结果与张洪亮等、杨汉春等的报道相符。
N端胞外域27~41 aa区域和C末端180~197 aa区域是PRRSV GP5蛋白2个重要抗原表位相关区域。相关研究显示，GP5蛋白的Ｃ端抗原表位在维持其蛋白构象方面具有重要作用。GP5蛋白具有3个重要抗原表位，分别为中和抗原表位37~45 aa、非中和抗原表位（又称诱饵表位）27~30 aa和非中和抗原表位180~197 aa。非中和抗原表位27~30 aa和中和抗原表位37~45 aa在中和抗体产生过程具有关键作用，其中38和42~44 aa是病毒中和表位的识别位点，39~41 aa是病毒中和表位的结合位点。通过氨基酸比对结果分析发现，谱系1中PRRSV的中和表位及2个非中和表位均有突变，其中中和表位突变率低，为9.68%，2个非中和表位27~30和180~197 aa突变比例相比中和表位更高，180~197 aa表位突变比例高达96.77%，这可能对中和抗体产生及GP5蛋白构象产生影响，导致PRRSV免疫失败。
谱系3中PRRSV的3个表位均发生突变；谱系5中PRRSV及20200624-262-JS各有2个表位发生突变，其中180~197 aa表位均发生突变；谱系8中的PRRSV只有中和表位及非中和表位180~197 aa发生突变，且突变比例均为100%，其中中和表位突变位点主要为39 aa，而该位点是病毒中和表位的结合位点，这或对GP5蛋白构象及中和抗体对病毒的结合能力产生影响，也可能对蛋白免疫原性产生影响，更利于病毒免疫逃避，影响现有疫苗免疫保护效果。
据相关研究，GP5蛋白R13和R151与PRRSV毒力相关，是潜在毒力位点。60个PRRSV仅20200624-262-JS的2个位点均未发生突变，其余59个PRRSV均发生不同程度突变，尤其谱系1中PRRSV的R13位点突变比例高达96.77%，这对NADC30-like PRRSV的毒力影响程度有待进一步研究。GP5蛋白具有多个糖基化位点，这些糖基化位点严重影响病毒蛋白的正确折叠及生物学特性，可形成糖基屏蔽效应有利于病毒免疫逃避及持续性感染。
通过N-糖基化位点预测发现，60个PRRSV糖基化位点数量及分布相比各自谱系参考毒株均存在不同程度差异，这也表明不同PRRSV免疫逃避能力存在差异，因而加重了PRRS防控的复杂程度。
疫苗免疫是PRRS防控的重要手段。我国目前商品化的PRRSV疫苗均为PRRSV2且属于谱系8，与当下田间流行的NADC30-like PRRSV野毒株同源性较低。PRRSV弱毒活苗对不同野毒株具有交叉保护性，其与野毒株同源性高低可能与保护率无关。Opriessnig等在猪群免疫PRRSV弱毒活苗后，用与疫苗毒同源性仅为76%的高毒力PRRSV攻毒，发现免疫组比未免疫组肺脏损伤率低37.8%，仅为4.2%。据报道，TJM-F92等PRRSV弱毒活苗与NADC-like PRRSV同源性虽大多小于89%，但对NADC-like PRRSV仍可提供有效临床保护，减轻临床症状，缩短发病时间，改善平均日增重。由此可知，PRRSV弱毒活疫苗对同源性低的野毒株也可提供一定的交叉保护，对免疫猪群可提供有效的临床保护，改善猪群体况。总之，PRRS需要综合防控，猪场除可选用安全有效的PRRSV弱毒活疫苗外，猪场生物安全及饲养管理也具有重要作用。
|
