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摘要：猪流行性腹泻（PED）是由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的，以腹泻为主要症状的急性肠道传染病，是长期以来危害我国养猪业健康发展的常见疾病之一。PEDV通过基因插入、缺失和重组等方式不断发生演化和变异，高致病力毒株、变异毒株不断出现，各类毒株之间的抗原性存在明显差异，导致临床上猪腹泻情况更加复杂。自2010年10月以来，由PEDV变异株引起的PED在我国大规模暴发流行，用经典毒株制备疫苗的免疫效果并不理想，因而造成重大经济损失。本文综述了PEDV在我国的流行现状及分子遗传演化特征，旨在为PED疫苗和诊断试剂研发提供参考。
猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）属于冠状病毒科甲型冠状病毒属，可引起猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED），导致患病猪腹泻、呕吐、厌食、脱水和体重减轻，并可导致哺乳仔猪大量死亡。PEDV有囊膜，基因组为单股正链RNA，长度约28 kb，含有7个开放阅读框（ORFs），分别编码2个大的多聚蛋白（pp1a和pp1b）、4个结构蛋白[棘突蛋白（S）、膜蛋白（M）、囊膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）]和1个附属蛋白（ORF3）。S蛋白是三聚体糖蛋白，位于病毒粒子表面，在病毒粘附、受体结合以及病毒进入细胞时与细胞膜融合方面起重要作用。S蛋白分为N端的S1区和C端的S2区，其中S1区受到的免疫压力大于S2区，因此S1区与PEDV毒力有关，并且在免疫压力下可快速突变。S蛋白也是产生中和抗体的主要蛋白，目前已鉴定出至少5个中和抗原表位：N端的S10区（NTD/S10）、胶原蛋白酶等效区（COE）、S1D区的SS2和SS6、C端的2C10。因此，S基因常用于PEDV遗传演化研究。
PED于1971年首次在英国被报道，起初被命名为流行性病毒腹泻（EVD）。1978年，比利时科学家通过试验证实了这种新发现的冠状病毒可导致猪腹泻，将其命名为CV777。1982年，由该种病毒引起的仔猪腹泻被规范命名为PED。到2000年，PED在欧洲得到基本控制，但在亚洲，其危害程度仍然较严重，中国、日本、韩国等国家都有PED流行。2010年末，一种新型高致病性PEDV引发的疫情在我国华南地区某猪场暴发，并很快扩散到全国。亚洲（日本、泰国、韩国、菲律宾等）和美洲（美国、加拿大、墨西哥等）等地区也暴发此类疫情，导致大量哺乳仔猪死亡，给全球养猪业造成严重经济损失。2013年PEDV传入美国后，造成占美国养猪总量10%的700万头仔猪死亡；然而在欧洲（乌克兰除外）、非洲以及澳大利亚没有发现高致病性PEDV流行。本文将对PEDV在我国的流行特点及其遗传演化关系进行综述，以期为PED的预防控制，特别是疫苗研制提供参考。
国内PED流行特点
据相关文献报道，早在1973年我国可能就有PED流行。20世纪80年代早期到2010年，PED在我国一直呈散发或地方性流行，未见类似日本和韩国的大流行。据不完全统计，1987—1989年全国26个省（自治区、直辖市）由PED导致的死亡率占36种猪病总死亡率的1.74%，而传染性胃肠炎（TGE）占到9.53%。2004年在广西壮族自治区6个城市开展的调查显示：PED发病率为42.00%（4 658/11 090），病死率为5.69%（265/4 658）；中小猪发病率为46.70%（4 302/9 212），病死率为6.16%（256/4 302）；母猪发病率为18.96%（356/1 878），没有出现死亡。以上调查数据表明，PEDV主要引起仔猪发病和死亡，而对成年母猪引起的发病率低，症状也不严重。调查资料显示：2005—2007年仔猪发生PED占仔猪腹泻的46%。另一项研究应用多重RT-PCR方法，检测2009—2010年从全国多个省份采集的197份仔猪腹泻样品，结果发现PEDV阳性检出率为29.44%（58/197）、TGEV为0.51%（1/197）、猪轮状病毒（PoRV）为7.61%（15/197）。上述结果表明，尽管PED呈散发状态，但PEDV一度是引起我国仔猪腹泻的主要病原之一。
2010年10月前，PEDV灭活疫苗和弱毒疫苗的使用较好地控制了全国PED的流行，但2010年冬天，华南地区某猪场暴发新型高致病性PED并很快传遍全国，至少有29个省（自治区、直辖市）报道发生了PED大流行。此次PED暴发的特点是流行范围广，在发病地区几乎波及所有养猪场，不仅在我国大面积流行，在美国、墨西哥、日本、韩国、越南、泰国等全球主要生猪产地也都有大面积流行。研究显示，2010—2011年从华南、华东和华中地区9个省份采集的600多份猪组织和粪便样品中检测到的PEDV平均阳性率为58.32%。2012年，从全国12个省份采集仔猪小肠组织和粪便样品，用RT-PCR、胶体金等方法进行检测，结果发现PEDV感染率高达61.19%（134/219），显著高于TGEV和PoRV。2011年2月—2014年3月，在全国29个省份开展PED流行病学调查发现，样品阳性率为61.10%~78.49%，场阳性率为71.43%~83.47%。2016年，从全国17个省份采集1 272份样品进行检测，发现PEDV阳性率为28.93%。另外一项研究则显示，2012—2017年从全国15个省份采集的1 542份猪腹泻样品中，有1 235份检测为PEDV阳性，阳性检出率高达80.09%。具体到各省份情况来看：2013—2017年在云南省采集的435份猪腹泻样品中，PEDV阳性检出率为17.47%；2014—2018年从四川省和贵州省156个猪场采集的645份猪腹泻样品中，有84个猪场检测到PEDV，样品阳性检出率为35.81%；2015—2019年在河南省采集的575份猪腹泻样品中，PEDV阳性检出率为51.65%，其中2015年（40.68%）到2017年（39.29%）流行相对稳定，2018年大幅度提高（74.19%）；2017—2018年，从湖南省39个猪场采集的184份腹泻样品中，71.79%（28/39）的猪场检测到PEDV，样品阳性率为38.04%（70/184）。2019年，Chen等对PubMed、Google scholar、Cochrane library、Clinical Trials以及中国知网和维普数据库中有关我国大陆地区PEDV流行的45篇文章进行统计，时间跨度为1988年1月—2018年8月，结果发现PEDV平均流行率为44%，其中北方地区为37%，低于其他地区。以上调查结果表明，自2010年以来，PED在我国大范围流行，是导致仔猪腹泻的主要疾病，严重危害我国养猪业健康发展。
仔猪PEDV感染特征
2010年以后流行的PEDV主要引起哺乳仔猪发病，以2~7日龄仔猪发病率最高，发病最严重。10日龄内仔猪感染后出现腹泻，首先表现为严重的水样腹泻，并伴发呕吐、精神沉郁，在发病仔猪躺卧的地方会出现大量黄色恶臭的水样便；2~4日后大量死亡，死亡率一般为50%~100%。2013年PEDV导致华南地区超过100万头仔猪死亡，发病猪场生产率受到严重影响，严重破坏了我国生猪养殖业的健康发展，但对妊娠母猪和其他生长阶段猪群致病力不高，临床症状较轻。2015—2019年对河南发病猪场采集的575份样品检测发现，哺乳仔猪PEDV阳性检出率达到60.47%，而育肥猪和母猪相对低，分别为43.28%和29.37%。2010年以后发生的PED季节流行特征不明显，被PEDV污染的猪场全年都可发生仔猪腹泻，但在秋冬季节或冬春季节变换期间，由于气温变化显著，发病率相对更高。例如，春季和冬季采集样品的PEDV阳性检出率较高，分别为54.10%和66.87%，而夏季和秋季相对较低，分别为23.40%和40.43%。研究还发现，PEDV引起猪腹泻的同时，常伴随着其他肠道病毒感染。2015—2018年从全国22个省份采集543份腹泻样品进行检测发现，PEDV阳性检出率为66.85%，与其伴发感染的有13种肠道病毒[猪捷申病毒（PTV）、TGEV、猪萨佩洛病毒（PSV）、猪肠病毒（PEV）、哺乳动物呼肠病毒（MRV）、猪A组轮状病毒（GARV）、猪星状病毒（PAstV）、猪环曲病毒（PToV）、猪托克特诺病毒2型（TTSuV-2）、猪博卡病毒（PBoV）、猪嵴病毒（PKV）和猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）]，阳性检出率最低为3.58%（PSV），最高为81.55%（PKV）。不过在部分地区，PEDV与常见猪腹泻病毒混合感染的程度较低。2017—2018年，从云南省39个猪场采集184份腹泻样品进行检测发现，PEDV+TGEV共感染率为1.09%（2/184），PEDV+PoRV共感染率为3.26%（6/184），没有发现PEDV+TGEV+PoRV三重感染。
PEDV流行毒株基因分型
基因分型依据
为了更好地区分不同毒株，依据毒株出现的时间不同，将PEDV笼统地分为经典毒株和新变异毒株。经典毒株是20世纪70年代出现的毒株，而新变异毒株是指2010年以后全球流行的毒株。根据PEDV的S基因或其N端高变区S1区序列的同源性，将PEDV分为2个基因型——G1型和G2型，其中G1型又分为G1a和G1b亚型，G2型又分为G2a和G2b亚型。2014年1月，美国研究人员从1份疑似PEDV感染样品中分离到1株PEDV，将其命名为OH851，样品来源于感染母猪，但其哺乳的仔猪症状较轻，甚至无临床腹泻症状，也不死亡。与美国流行株（G2a）S基因序列比较发现，OH851毒株的S基因有3个缺失位点（167位缺失1个碱基，176位缺失11个碱基，416位缺失3个碱基）和1个插入位点（474~475位有6个碱基插入），同时，在S基因S1区的N端1 170 bp片段上还有几处核苷酸突变。OH851变异株S基因的碱基缺失、插入和突变很有可能是导致仔猪临床症状减轻的原因。该类新出现的毒株被命名为“S INDEL”毒株，其特点是对哺乳仔猪致病力低，致死率低，构成了G1b亚型（图1）；而与之相对的新出现毒株被命名为“non-S INDEL”毒株。“non-S INDEL”毒株是指强毒力毒株，是引起目前全球PED大流行的毒株，由G2a和G2b亚型构成（图1）。通常把以CV777毒株为代表的经典毒株归为G1a亚型。G1b（S INEDL）、G2a和G2b亚型都属于2010年以后新出现的毒株，其中G1b为低致病力变异毒株，G2a和G2b属于高致病力变异毒株，而G2b为高致病力重组变异毒株。可以预见，随着PEDV的流行和疫苗免疫压力的加大，PEDV分子演化会一直持续，可能会不断出现新的分支、亚型或基因型。
流行株基因分型
2010年前，亚洲多地发生PEDV流行，但多呈散发状态。对当时在亚洲流行的PEDV毒株进行基因分型和来源地进化分析发现，这些毒株包括我国的4个经典毒株（GenBank IDs：KC109141、JN547228、EF185992和JX560761），1个日本经典毒株（GenBank ID：KT968509）和3个韩国毒株（GenBank IDs：JQ023161、GU937797和KF898124）都属于G1a亚型。2010年末我国华南地区暴发新型高致病性PED后，各地有关新出现PEDV的分子特征和遗传演化关系的文献被大量发表。2012—2017年从我国15个省400个猪场采集的猪腹泻样品中获得了1 235条PEDV的S1基因序列，通过遗传演化分析发现，这1 235株PEDV分别属于G1a、G1b、G2a和G2b亚型，占比分别为1.9%、9.6%、32.2%和56.3%；与经典毒株CV777（GenBank ID：AF353511）比较发现，G1a、G1b、G2a和G2b亚型毒株的同源性分别为88.1%~95.49%、92.52%~95.39%、75.00%~89.25%和79.39%~89.44%。我国目前流行的PEDV主要是G2a和G2b亚型毒株。另一项调查显示：2016—2018年从全国22个省份采集样品中获得的147条PEDV的S1序列，与130条参考序列比较发现，29.25%属于G2a亚型，70.75%属于G2b亚型，没有发现G1基因型毒株；进一步分析发现，包括参考毒株在内的中国分离株中，64.79%的2011—2015年流行毒株、50.62%的2016年流行毒株、8.86%的2017—2018年流行毒株属于G2a亚型，19.72%的2011—2015流行毒株、49.38%的2016年流行毒株和91.13%的2017—2018流行毒株属于G2b亚型。结果表明，从2010年我国发生大面积高致病性PED以来，流行的PEDV属于G2a亚型的比率逐年减少，而属于G2b亚型的比率逐年增加（图2）。
在其他区域性研究中，2014—2018年从我国川贵地区15个城市的代表性猪场获得了52条PEDV的S全长基因，经遗传进化分析发现，13.73%的毒株属于“G1c”，1.96%属于“G2a”，23.53%属于“G2b”，60.78%属于“G2c”，没有发现G1a毒株。需要说明的是，该研究中定义的“G2a”和“G2b”其实与通用G2a属于同一分支，“G2c”即为通用的G2b，“G1c”即为通用的G1b。这些结果表明，我国西南地区PEDV遗传背景复杂，有多个基因亚型毒株同时流行。这可能是我国频繁的生猪跨省长途调运，增加了PEDV的流行风险和复杂性。2015—2019年，从河南省采集的猪腹泻样品中扩增出22条PEDV的S基因序列，经遗传演化分析发现，16株属于G2a亚型（高致病性变异毒株），6株（2017—2018年）属于G1b亚型（低致病性S-INDEL），说明河南省流行的主要是高致病性G2a亚型毒株；同时，2017年以后出现低致病性G1b亚型毒株，表明河南省流行的PEDV毒株有不同的进化来源。2017—2018年，在湖南、湖北、广西等8个省份39个猪场采集的184份腹泻样品中，扩增出有代表性的14株PEDV毒株S1基因，经基因遗传演化分析发现，11株属于G2a亚型，并且与2011年在湖北省分离的高致病强毒株AJ1102（JX188454.1）亲缘关系近，3株属于G2b，与2012年在安徽省分离的高致病毒株AH2012（KC210145.1）和美国2013年分离的高致病毒株USA/Colorado/2013（KF272920.1）亲缘关系近。
以上研究结果表明，2010年以后在我国流行的PEDV主要是高致病力毒株，分别属于G2a（变异强毒株）和G2b亚型（重组强毒株），与经典毒株G1a亚型包括CV777弱毒株和强毒株亲缘关系远，与G1b亚型（S-INDEL类毒株）亲缘关系也较远。同时也看到，S-INDEL毒株在我国流行比较复杂。一段时间认为2015年分离的ZL29是唯一一株S-INDEL毒株，但后来发现2004年分离的JS-2004-2、CH5毒株和2012年分离的CH/SDZB/2012毒株也属于S-INDEL毒株。这提示，早在2004年我国可能就有S-INDEL毒株流行，只是在2013年前一直处于个别地区散发状态，低于G2基因型毒株的流行范围，但2013年以后，该亚型毒株开始在西南和华南地区流行。这些信息表明，我国流行的PEDV基因型复杂，有多种基因型同时流行。
PEDV流行株变异
PEDV全基因组序列分析表明，PEDV变异株存在4个高变区：V1—V4。V1主要包括nsp2基因的C端和nsp3的N端；V2位于S基因的S1区，参与病毒受体结合，该区域的改变可以导致PEDV跨物种或跨器官传播；V3包括S基因的C端和ORF3；V4存在于N基因中，与以往认为的N基因高度保守的观点不一致。PEDV的S基因，特别是在S1区最容易发生变异。与经典毒株CV777比较，新出现的PEDV变异株S1区（1~2 217 nt）存在3个插入部位（162、170~180和413~415位）和1个缺失部位（470~475位），S1区也有3个重要的抗原决定簇发生突变（248~280、442~499和697~742 aa），这3个抗原决定簇的改变可能是导致新出现PEDV变异株毒力增强和经典疫苗株免疫保护失败的主要原因。
对2016—2018年的147份样品扩增PEDV的S1序列，经测序和同源性比较发现，147个S1序列的核酸同源性为95.5%~99.9%，氨基酸同源性为94.2%~99.7%，而与CV777（GenBank IDs：AF353511）比较，核苷酸同源性为90.7%~91.8%，氨基酸同源性为89.3%~90.7%。为进一步研究S1蛋白的遗传进化特点，从NCBI上下载53条S1序列（2011—2014年24条、2015年29条），并将推导出S1蛋白氨基酸序列作为参考序列；将53条参考序列与147条获得的S1蛋白氨基酸序列（2016年72条、2017年46条、2018年29条）进行比较发现，2015—2018年PEDV的S1蛋白平均氨基酸突变数分别是13.0、17.11、18.87和16.17。S1蛋白的V13A、L17F、G68Y、G70R、N139D、Y182H、M214T、P229L、T235I、I287M、H301Q、S334A、I503T、S524A、K570N、G616V和P638S的氨基酸突变概率从2015年到2018年持续增加；2017年PEDV毒株S1蛋白的L14I、A193S、R195N、D223G、T379I、G432S、E640V、F674V、D683A、P770L和T781M发生了突变，2018年V77A、H110Y、A112S、I154T、S246L、D304G、A331V、Y610H、A612D和 K637T发生了突变。
2017—2018年，从我国湖南、湖北、广西等8个省份39个猪场采集的184份腹泻样品中，扩增出有代表性的14株PEDV毒株S1基因，发现其中1株（HN-SY-2017-Oct）有9个核苷酸插入T1152GAA GCC AAT1160T，编码3个氨基酸381KPI383，还有1株（ZJ-2018-May）有3个核苷酸缺失1126AAA1127，编码1个氨基酸372K。14株S1基因的核苷酸同源性为97.2%~100%，氨基酸同源性为95.8%~100%；与CV777弱毒株S1（GenBank ID：KT323979.1）序列比较，核苷酸和氨基酸同源性分别为90.7%~91.6% 和89.1%~90.0%，而与CV777强毒株（GenBank ID：AF353511）S1序列比较，核苷酸和推导氨基酸的同源性分别为90.7%~91.6%和88.5%~89.1%；与我国高致病性强毒株AJ1102（JX188454.1）的S1基因核苷酸和推导氨基酸同源性分别为97.3%~98.7%和97.2%~98.2%，与美国高致病性强毒株USA/Colo-rado/2013（KF272920.1）的核苷酸和氨基酸同源性分别为97.9%~99.5%和97.2%~99.2%；而与致病力弱的S-INDEL OH851株同源性较低，分别为91.9%~92.9%和90.7%~92.5%。这也许能部分解释经典CV777疫苗株预防PEDV流行强毒株失败的原因。
研究发现，我国流行的PEDV毒株中存在S基因重组，从而出现新的重组毒株。为了确定PEDV流行株S基因是否存在重组位点，采用RIP软件分析高致病力变异株CH-HNAY-2017（G2a）、CH-HNZMD-2017（G1b，S INDEL）与参考毒株包括经典毒株（G1a 亚型CV777和DR13）、S INDEL毒株（G1b 亚型KNU-1406-1和OH851）、重组毒株（CH-HNYF14）和高致病力变异毒株（G2a 亚型CH-ZMDZY-11和USA-Colorado-2013）。结果显示：分离株CH-HNAY-2017（G2a）、CH-HNZMD-2017（G1b，S INDEL）的S基因上存在重组位点；CH-HNAY-2017（G2a）的S基因与参考毒株CH-ZMDZY-11和USA-Colorado-2013有更高的相似性，CH-HNZMD-2017（G1b，S INDEL）S基因与参考变异株CH-ZMDZY-11、USA-Colorado-2013有更高的相似性。用Simplot软件分析发现，CH-HNAY-2017和CH-HNZMD-2017的S基因上都有几处潜在重组位点。这些结果表明，除了碱基的插入、缺失导致PEDV毒株变异外，不同毒株S基因的重组也是PEDV遗传进化的重要方式。
挑战及展望
PEDV是目前危害我国养猪业最重要的病原之一，几乎在所有省份都有流行，并且通过基因的插入、缺失和重组等方式不断发生演化和变异。高致病力毒株、变异毒株不断出现，各类毒株之间的抗原性存在明显差异，导致临床上被感染仔猪发生腹泻的情况更加复杂。临床实践和研究表明，用经典毒株制备的疫苗预防新出现的变异毒株，免疫效果并不理想。已有试验证明，在细胞水平，用经典毒株诱发的抗体不能有效中和新出现的变异毒株。这些都表明，随着PEDV的不断演化，用当前流行毒株研制新疫苗是预防PEDV流行的持续性迫切需求。对于PEDV的传播，除了经典的“粪-口”途径和最近确定的通过气溶胶经呼吸道感染途径外，是否还有其他传播途径，是否可以通过乳汁经消化道感染和经胎盘垂直传播，这些都需要进行不断研究，以指导临床防制实践。同时，PEDV疫苗的免疫机制还不十分明确，血清中和抗体以及细胞免疫在疫苗免疫中的作用如何？是否只有乳汁分泌型IgA在发挥免疫作用？以上这些问题都为有效防制PED提出了新的挑战，同时也为今后开展PEDV研究指明了方向。持续开展PEDV分子演化分析以及疫苗免疫机理、新疫苗研究将有助于预防和控制PED在我国的流行。
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