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河南省安阳市猪链球菌2型分布及其药物敏感性


现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2023/1/14 10:00:01 关注:1011 评论: 我要投稿

  摘要:为了解河南省安阳市猪链球菌2型(SS2)的分布范围、生化特性及其药物敏感性,收集了来自该地区9个县(市、区)的56份疑似感染病料,分离后用PCR鉴定出38株猪链球菌菌株,其中21株(55.3%)为SS2,分离自安阳县、汤阴县、滑县、文峰区、北关区、殷都区、龙安区7个县区采集的病料样品。生化试验发现,分离菌株与SS2菌株的生化特点相符合;药物敏感性分析发现,全部SS2菌株对氨苄西林和头孢曲松敏感,20株对头孢呋辛敏感,19株对阿莫西林和头孢噻肟敏感;全部SS2菌株对卡那霉素、阿米卡星和磺胺异恶唑耐药,20株对庆大霉素和四环素耐药,19株对阿米卡星耐药。结果表明,SS2在河南省安阳市分布范围较广,是该地区猪链球菌的优势流行亚型,且流行菌株存在多重耐药性。本研究为有效防控该地区猪链球菌病提供了参考。
  猪链球菌病是由多种不同血清群链球菌引起的,具有不同临诊症状传染病的总称,以淋巴结脓肿、脑膜炎、关节炎及败血症为主要临床特征。猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是猪链球菌病的主要病原体,引起疾病谱多种多样,包括但不限于脑膜炎、败血症、肺炎、心内膜炎。通过荚膜抗原,SS可分为35个血清亚型,其中SS2是最常从病猪体内分离到的一种亚型,致病力最强,各地检出率也最高,而且可感染人并致死,引起的疾病为人兽共患病,因此其不仅给全球养猪业造成重大经济损失,而且威胁食品安全和人类健康。
  最早的人类SS感染病例于1968年报道,随后多个病例在欧洲、亚洲及北美被报道。SS可通过垂直传播和水平传播两种途径感染猪。SS通常潜伏在规模养殖猪的扁桃体内,当携带病原仔猪的母源抗体逐渐消失时,可从扁桃体或其他黏膜表面向全身播散,继而发展为菌血症、败血症、心内膜炎、脑膜炎等。具体而言,SS致病的前提是细菌突破上皮细胞的多种屏障,进入血液,并在循环中大量增殖,随后随血流侵袭不同的器官,引起炎症反应,严重者可发生脓毒性休克而危及生命。SS感染主要表现为急性发病,寒战、高热,可伴有呕吐、腹泻、头痛、肌肉关节疼痛等全身中毒性症状,病程发展迅速,可在1 d内累及中枢神经系统,出现休克、肝肾功能不全、凝血障碍。另外,目前部分SS菌株也出现了多重耐药性,若早期盲目使用不敏感抗生素,则会错过最佳治疗时机。
  本研究明确了河南省安阳市的SS2地域性分布、生化特点及耐药情况,为有效防控猪链球菌病提供了有力支持。
  材料与方法
  材料
  主要试剂 胰蛋白胨大豆酵母浸膏肉汤(TSB)和胰蛋白胨大豆酵母浸膏琼脂(TSA),为青岛高科技工业园海博生物技术有限公司产品,按说明书配制、灭菌后,分别按体积分数5%、10%,每升加入50 mL小牛血清。2×Taq Mix、DL 2 000 DNA Marker,为翌圣生物科技(上海)股份有限公司产品;胎牛血清,为浙江天杭生物科技股份有限公司产品。
  标准菌株 SS2标准菌株,购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC号为3930,原始编号为ATCC 700796)。
  药敏纸片 庆大霉素、卡那霉素、四环素、阿奇霉素、阿莫西林、氨苄西林、头孢呋辛、头孢曲松等16种抗菌药物药敏纸片,购自杭州滨和微生物试剂有限公司及Oxoid公司。
  主要仪器 PCR仪,Applied Biosystems公司产品;凝胶成像系统,上海金鹏分析仪器有限公司产品;二级生物安全柜,苏州安泰空气技术有限公司产品;隔水恒温培养箱,上海舍岩仪器有限公司产品。
  方法
  SS2菌株PCR检测以及生化特性、药敏性检测等操作,均在生物安全二级实验室进行,并严格执行生物安全措施。
  受试菌株分离 受试菌株由滑县动物疫病预防控制中心在无菌条件下分离,参考刘丽蓉等的方法进行,样品采自安阳县、北关区、文峰区、林州市、殷都区、龙安区、汤阴县、内黄县和滑县疑似SS感染病猪,样本为猪关节液、肺组织和脑组织。
  链球菌PCR鉴定 采用裂解法提取细菌DNA:挑取单菌落接种到含有5%(体积分数)血清的TSB中,培养24 h;取1 mL菌液加入1.5 mL离心管中,10 000 r/min离心5 min,弃上清液;加入100 μL灭菌ddH2O,置沸水中煮沸10 min,冰浴10 min,10 000 r/min离心10 min,取上清液,即为DNA模板。使用Applied Biosystems公司的PCR仪,分别加入设计好的SS和SS2引物,以DNA为模板分别进行扩增。参考菌株基因号为CP100432,SS鉴定引物(F:TTCCAATCGGCGGTGGTAAA;R:TCGCACATGGAAGGGCAATA)扩增长度为566 bp,SS2鉴定引物(F:AGTGATTTGTCGGGAGGGTT;R:ATGCCACTGTAGCGTCTCTT)扩增长度为498 bp。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR体系:2×Taq Mix 12.5 μL,双蒸水9.5 μL,上下游引物各1.0 μL,模板2.0 μL;反应程序:95 ℃预变性2 min;95 ℃ 15 s,55 ℃ 15 s,72 ℃ 60 s,35次循环;72 ℃延伸10 min。PCR扩增,参照赵朴等的方法进行,取出产物后使用1%琼脂糖进行凝胶电泳检测。
  SS2生化试验鉴定 SS2生化试验鉴定参考刘丽蓉等的方法进行。
  SS2药敏试验 将分离纯化的SS2菌株按常规方法进行药敏试验。
  结果
  细菌培养特性
  在含有10%(体积分数)胎牛血清的TSA平板上,分离菌株长出大量半透明、针尖大小、光滑、湿润的小菌落,革兰氏染色阳性,成对或呈短链状排列,符合SS菌落形态及特点。
  SS分离株PCR鉴定
  从56份病猪样品(包括关节液、肺组织和脑组织)中,共分离鉴定出来自于全市9个县区的38株SS菌株(图1),其中21株为SS2菌株(图2),占55.3%,从安阳县、汤阴县、滑县、文峰区、北关区、殷都区、龙安区7个县区采集样品中分离到(表1)。在17份关节液标本中,分离出11株SS菌株,其中6株为SS2菌株;21份脑标本中,分离出16株SS菌株,其中10株为SS2菌株;在18份肺标本中,分离出11株SS菌株,其中5株为SS2菌株。

  生化鉴定
  为进一步确认SS2分离菌株的生化特性,挑选经PCR鉴定为SS2的菌株进行糖发酵、V-P等生化试验。结果(表2)显示,棉子糖、乳糖、七叶苷发酵试验为阳性,甘露糖、阿拉伯糖、山梨糖、菊糖、松三糖、甘露醇、D-核糖、甘油发酵试验及V-P试验均为阴性,在高盐肉汤(6.5%)和肉汤(pH9.6)中均不能生长,全部符合SS2的生化特点。

  药敏试验
  为分析SS2对常用抗菌药物的敏感性,使用16种抗菌药物药敏纸片检测SS2分离菌株的药敏情况。结果(表3)显示:全部21株SS2菌株对氨苄西林和头孢曲松敏感,20株对头孢呋辛敏感,19株对阿莫西林和头孢噻肟敏感;而全部21株SS2菌株对卡那霉素、阿米卡星和磺胺异恶唑耐药,20株对庆大霉素和四环素耐药,19株对阿米卡星耐药。

  讨论
  SS是导致猪链球菌病最主要的病原,能通过黏膜或伤口等传播途径感染人,从而对人类生命健康构成致命威胁。近年来,SS主要引起两种人类疾病,即败血症合并感染性休克和脑膜炎,而且此类疾病的发病率也越来越高。因此,按照国家“人病兽防、关口前移”的总要求,了解SS的地域性亚型分布以及生化特征和药物敏感性对防治SS人畜感染,减少畜牧业损失和促进人类健康都具有重要意义。
  SS的血清型可分为35种,不同亚型对人和猪的致病力也强弱不一。目前有6种血清亚型被重新分类,其中32和34亚型归类为Streptococcus orisratti,20、22和26亚型归类为Streptococcus parasuis,33亚型归类为Streptococcus ruminantium。SS2亚型致病力极强,可由病猪传染给人,引起人急性脓毒性休克,预后极差,因此需在诊疗过程中明确感染的SS类型,以便早发现、早治疗。PCR技术的发展及全基因组测序的应用使人们能够进一步鉴别和明确SS的亚型类别。本研究从56份病猪样品分离出38株SS,在关节液、脑组织和肺组织中均有检出,其中21株被进一步鉴定为SS2亚型,占全部SS分离菌株的55.3%,分布在安阳县、滑县、汤阴县、文峰区、北关区、殷都区、龙安区7个县区。这提示SS2是安阳市SS优势流行亚型,且流行范围较广。
  生化试验显示,糖发酵试验阳性者细菌生长良好,能发酵糖产酸;阴性者不生长,不发酵糖也不产酸。SS对糖发酵的阳性反应普遍包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖和胆汁七叶苷等,部分菌株阳性反应还包括棉子糖、甘露醇等。糖发酵生化试验结果提示,棉子糖、乳糖、七叶苷发酵试验为阳性,说明SS2可正常生长,这均符合SS2 的生化特点。
  考虑到SS2的高致病性,进一步研究了SS2分离菌株对16种抗菌药物的敏感性,结果全部21株SS2菌株对卡那霉素、阿米卡星和磺胺异恶唑耐药,20株对庆大霉素和四环素耐药,19株对阿米卡星耐药,表明SS2分离菌株存在多重耐药性。因此,临床治疗时,需考虑细菌的耐药情况,最好通过药敏试验筛选敏感抗菌药物,避免盲目用药,贻误病情。另外,应制定合适的抗菌药物组合,避免使用耐药药物,对高敏的抗菌药物应合理搭配,以保障治疗的有效性。最后,在预防和治疗链球菌病过程中,同一种抗菌药物使用时间不宜过长,应辅以组合用药,避免耐药性加重。
  本研究了解了河南安阳市猪群中的SS2地域性分布及其药物敏感性,对该地区猪链球菌病防控具有借鉴意义。

文章来源:中国动物检疫     文章作者:苏红辽等     文章编辑:一米优讯     
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