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黄藤素(Fibriuretinin)为防己科植物黄藤(Fibraurea recisa Pierre.)干燥藤茎中提取得到的生物碱，其有效成分为盐酸巴马汀，黄藤素(Fibriuretinin)具有广谱抑菌抗病毒作用，增强白细胞吞噬能力的作用，对多种革兰氏阳性菌和阴性菌如霉菌、葡萄球菌、支原体、衣原体、白色念珠菌等有较强抑制作用，良好的抗炎和增强机体免疫力作用，具有清热解毒的功效，可广泛用于猪羊的菌痢、肠炎和呼吸道感染等。黄藤素及其注射液已收载于《农业部第1506号公告》，黄藤素含量测定中采用高效液相色谱法而制剂黄藤素注射液却采用重量法(测定总碱含量)，该方法专属性差、耗时长、不能快速测定、不利于生产控制，为了提高黄藤素口服液的稳定性和用药安全性，作者研制了黄藤素口服液并建立了有效成分盐酸巴马汀含量的HPLC检测方法，此法能够快速检测结果准确方便易行，且稳定性和重现性良好。
一、仪器与试剂
1.仪器 LC-10Avp型高效液相色谱仪(日本岛津);UV2501-PC型紫外可见分光光度计(日本岛津)。
2.试剂 盐酸巴马汀对照品(中国兽医药品监察所);黄藤素口服液(自制，规格：100ml：2g)，乙腈(色谱纯，天津市四友精细化学品有限公司，批号：120621101);水为注射用水;其它试剂为分析纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)。
二、方法与结果
1.波长检测
取盐酸巴马汀对照品50.1mg置100ml容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，取其1ml置50ml容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，摇匀，取1ml放入1cm比色皿中，以水为空白在200nm-500nm范围内进行扫描，结果显示盐酸巴马汀对照品在270nm、272nm、273.5nm和345nm波长处有4个吸收峰，且在345nm波长处有最大吸收峰，因此选择345nm为检测波长。
2.色谱条件
色谱柱：KromasiloDs-C18柱(250mm×4.6mm，5um);流动相：乙腈-水-冰醋酸-二乙胺(31:68:1:0.2);检测波长为345nm;柱温37℃;流速为1ml/min;进样量：10ul;理论板数按盐酸巴马汀峰计算应不低于2000，分离度大于1.5。
3.供试品溶液与对照品溶液的制备
对照品溶液的制备
精密称取105℃干燥至恒重的盐酸巴马汀对照品0.03988g，置100ml容量瓶中，加流动相适量使溶解并定容至刻度，摇匀，即得(含盐酸巴马汀398.8ug/ml)。
供试品溶液的制备
精密量取黄藤素口服液(规格：100ml：2g)5ml，置50ml容量瓶中，加流动相适量并定容至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml置50ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。
4.空白溶液干扰试验
按黄藤素口服液的处方比例不加主料黄藤素，其它制备工艺均相同，制得的溶液作为空白溶液，按照供试品溶液的制备方法进行，并精密量取对照品溶液和空白溶液的供试品溶液各10ul注入液相色谱仪，测定，测得吸收峰面积为零，结果表明：本品空白溶液不干扰主要成分黄藤素的检测。
5.线性关系试验
精密量取对照品溶液0.3ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、5.0ml，分别置10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10ul注入液相色谱仪，按上述色谱条件进行测定，记录峰面积，以峰面积为纵坐标，盐酸巴马汀对照品量(ug)为横坐标作图，回归方程Y=24961X+31146(r=0.9999，n=6)，表明浓度在11.96~199.4ug/ml范围内，与峰面积呈良好的线性关系。
表1 黄藤素口服液线性关系试验数据
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编号 |
对照品溶液体积（ml） |
对照品浓度（ug/ml） |
峰面积 |
|
1 |
0.3ml |
11.96 |
330032 |
|
2 |
0.5ml |
19.94 |
560154 |
|
3 |
1.0ml |
39.88 |
1010108 |
|
4 |
2.0ml |
79.76 |
2000550 |
|
5 |
3.0ml |
119.64 |
3011525 |
|
6 |
5.0ml |
199.4 |
5020742 |
图1黄藤素口服液线性试验图
6.精密度试验
精密量取对照品溶液1.0ml，置10ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密吸取10ul注入液相色谱仪，按上述色谱条件连续进针测定5次，记录色谱图中峰面积，RSD为0.15%。(见表2)
表2 黄藤素口服液精密度试验
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编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
平均值 |
SD |
RSD% |
|
峰面积 |
1009375 |
1011200 |
1010308 |
1013457 |
1011230 |
1011114 |
1515.277 |
0.15 |
7.重复性试验
取同一批号的黄藤素口服液样品各5份，精密量取，按供试品溶液的制备方法配成供试品溶液，平行试验5次，测定其盐酸巴马汀含量，结果含量测定的RSD为2.0%(n=5)。(见表3)
表3 黄藤素口服液重复性试验
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编号 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
平均值 |
SD |
RSD% |
|
峰面积平均值 |
1011965 |
1012458 |
1016928 |
1014889 |
1012829 |
1013814 |
2066.421 |
0.20 |
8.稳定性试验
精密量取供试品溶液，于室温下分别放置0、1、2、3、5、8小时，精密吸取10ul注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图中峰面积，RSD为0.18%。(见表4)
表4 黄藤素口服液稳定性试验
|
时间（小时） |
0 |
1 |
2 |
3 |
5 |
8 |
平均值 |
SD |
RSD% |
|
峰面积平均值 |
1011965 |
1013965 |
1014989 |
1012345 |
1016796 |
1014998 |
1014176 |
1816 |
0.18 |
9.加样回收率试验
精密量取黄藤素口服液(规格：100ml：2g)5ml，置50ml容量瓶中，加流动相适量并定容至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1ml置50ml容量瓶中，分别按处方量的80%、100%、120%称取盐酸巴马汀对照品1.6mg、2mg、2.4mg分别置上述50ml容量瓶中，并作平行试验，加流动相稀释至刻度，摇匀，即得。精密吸取10ul注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图中峰面积，结果平均回收率为99.34%，RSD为0.45%。(见表5)
表5 黄藤素口服液加样回收率试验
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样品 |
加入量（mg） |
回收量（mg） |
回收率% |
平均回收率% |
SD |
RSD% |
|
1 |
1.61 |
1.59 |
98.76 |
99.34 |
0.446 |
0.45 |
|
2 |
1.63 |
1.63 |
100.0 |
|
3 |
2.02 |
2 |
99.01 |
|
4 |
2.03 |
2.02 |
99.51 |
|
5 |
2.48 |
2.46 |
99.19 |
|
6 |
2.46 |
2.45 |
99.59 |
10.黄藤素口服液样品测定
分别取黄藤素口服液中试样品三批，供试品溶液的制备方法进行，按上述色谱条件测定，记录色谱图中峰面积，结果见表6。
表6 黄藤素口服液含量测定
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批号 |
样品编号 |
含量（%） |
平均值（%） |
RSD% |
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20130301 |
1 |
99.98 |
99.94 |
0.06 |
|
2 |
99.9 |
|
20130302 |
3 |
100.3 |
100.25 |
0.07 |
|
4 |
100.2 |
|
20130303 |
5 |
99.76 |
99.82 |
0.09 |
|
6 |
99.88 |
三、讨论
黄藤素口服液比黄藤素注射液给药途径更方便易行，而且工艺简单、成本低、污染少、不用灭菌，适合工业化生产。经检验各项指标均符合规定，该制剂克服现有常规产品的不足，提出一种安全、绿色、天然、高效、应用范围广、口感好、给药方便、工艺简单的黄藤素口服液制备方法。该产品可替代部分抗生素，弥补了国内兽药市场在中兽药产品和剂型方面的空白，充分体现了黄藤素制剂在中兽药中的优势，是国内制剂产品加工技术的重大突破，为国内猪羊在菌痢肠炎等疾病治疗方面开辟了新产品新组方，促进国内猪羊健康养殖新概念，同时也提升了兽药行业的自主创新能力。药典中收载的黄藤素注射液采用重量法(测定总碱含量)，经长期检验此药典方法专属性差、耗时长、不能快速测定、不利于规模化生产和生产过程中的质量控制，而黄藤素所采用的含量测定方法不适宜制剂的测定，并且干扰峰、杂质峰和有关物质不能准确分离，检测中存在误差较大，盐酸巴马汀分子结构中含有N原子，易造成拖尾，试验中比较了多种波长、流动相、流速、柱温和进样量之间的干扰和影响，最终确定色谱柱为KromasiloDs-C18柱(250mm×4.6mm，5um);流动相为乙腈-水-冰醋酸-二乙胺(31:68:1:0.2);检测波长为345nm;柱温37℃;流速为1ml/min;进样量为10ul，能较好的分离盐酸巴马汀和其它成分，并且线性、精密度、稳定性、重复性、回收率良好，适合规模化大生产的需求，此方法可广泛用于黄藤素及其制剂的研发、生产和产业化的含量检测。
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