|
动物源性食品中细菌的检测——链球菌
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2021/6/30 12:22:44 关注：748 评论： 我要投稿
|
|
链球菌普遍存在于各种动物体内，大多数是宿主特异性的，不同的菌株感染不同种动物。链球菌可导致一系列的疾病，包括脑膜炎、败血症、多发性浆膜炎、关节炎、心内膜炎和肺炎。链球菌在鼻炎和流产的病例中也曾被分离到，说明它还和这两种病症有关。链球菌感染发病模式与严重程度因不同地区而异。链球菌有很多个血清型，其中猪链球菌至少有34个血清型。它们在致病性和临床症状方面各不相同，且同一血清型的致病性和临床症状在不同情况下也会有不同表现。有些血清型主要是从健康猪体内分离得到的，不具致病性；有的主要造成肺部损伤；有的可感染猪，也可感染其他动物。有的血清型，主要是2型，不仅可导致猪脑膜炎，偶尔还会造成人脑膜炎。
1 病原学特征
1.1 形态与染色
链球菌呈球形或卵圆形，直径0.6～1.0μm，呈链状排列，短者由4～8个细菌组成，长者由20～30个细菌组成，链的长短与细菌的种类和生长环境有关。在液体培养基中易呈长链，在固体培养基中常呈短链，由于链球菌能产生脱链酶，所以在正常情况下链球菌的链不能无限制地延长。多数菌株在血清肉汤中培养2～4h易形成透明质酸荚膜，继续培养后荚膜可被细菌自身产生的透明质酸酶分解而消失。该菌不形成芽孢，无鞭毛，易被普通的碱性染料着色，革兰氏染色阳性，长时间培养或被中性粒细胞吞噬后转为革兰氏染色阴性。
1.2 培养特征
需氧或兼性厌氧菌，对营养的要求较高，在普通培养基上生长不良，需补充血清、血液、葡萄糖等才能生长。最适生长温度为37℃，在20～42℃下能生长，最适pH为7.4～7.6。在血清肉汤中易呈长链，管底呈絮状或颗粒状沉淀生长。在血平板上形成灰白色、半透明、表面光滑、边缘整齐、直径0.5～0.75mm的细小菌落，不同菌株有不同溶血现象。
1.3 生化反应
分解葡萄糖，产酸不产气，对乳糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、棉子糖、海藻糖、七叶苷的分解能力因不同菌株而异。一般不分解菊糖，不被胆汁溶解，触酶试验阴性。
1.4 抗原结构
链球菌的抗原构造较复杂，主要有三种：
（1）核蛋白抗原 或称P抗原，无特异性，各种链球菌均相同，与葡萄球菌有交叉。
（2）多糖抗原 或称C抗原，为群特异性抗原，是细胞壁的多糖组分，可用稀盐酸等提取。应用多糖抗原，根据兰氏（Lancefield）血清学分类，可将链球菌分成许多群。目前有A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、M、N、O、P、Q、R、S、T、U19个血清群，每个血清群又有若干个血清型。根据菌体荚膜抗原特性不同，猪链球菌共可分成35个血清型，即1～34型和同时含有1型和2型抗原的1/2型。
（3）蛋白质抗原 或称表面抗原，具有型特异性，位于多糖抗原外层，其中可分为M、T、R、S4种不同性质的抗原成分。与致病性有关的是M抗原，M抗原具有抗吞噬作用，并使链球菌易于黏附在上皮细胞上。根据M抗原不同可将A群链球菌分为60多个血清型。R、T、S抗原与致病性和毒力关系不大，但可用于链球菌的分型。
1.5 分类
根据链球菌在血液培养基上生长繁殖后是否溶血及其溶血性质，将其分为三类。
1.5.1 α-溶血性链球菌
菌落周围有1～2mm宽的草绿色溶血环，也称甲型溶血性链球菌，这类链球菌多为条件致病菌。
1.5.2 β-溶血性链球菌
菌落周围形成一个2～4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，也称乙型溶血性链球菌，这类菌亦称为溶血性链球菌，该菌的致病性强，常引起人类和动物的多种疾病。
1.5.3 γ-链球菌
不产生溶血素，菌落周围无溶血环，也称为丙型或不溶血性链球菌，该菌无致病性，常存在于乳类和粪便中，偶尔也引起人或动物感染。
1.6 抵抗力
该菌抵抗力一般不强，60℃经30min即被杀死，对常用消毒剂敏感，在干燥尘埃中可生存数月。乙型链球菌对青霉素、红霉素、氯霉素、四环素、磺胺均敏感。βＧ内酰胺类药物是链球菌感染的首选药物。
2 流行病学特征
链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播感染或通过皮肤、黏膜伤口感染，被污染的食品如肉、蛋、乳及其制品也会感染人类。上呼吸道感染患者、人畜化脓性感染部位常成为食品污染的污染源。
3 危害
链球菌种类多，与人类有密切关系的是猪链球菌。在猪链球菌众多血清型中，2型链球菌是猪的最主要病原，致病性最强。链球菌的致病性与溶菌酶释放蛋白、胞外蛋白因子、溶血素等毒力因子有关。
在我国，2005年四川部分地区发生的2型猪链球菌病暴发流行导致200多人感染、38人死亡。在荷兰，每年屠宰场的工人和养殖场饲养员患猪链球菌脑膜炎的比率大约为3/100000，是不在屠宰场工作的人患猪链球菌脑膜炎的1500倍，屠夫患猪链球菌脑膜炎的比率为1.2/100000。在德国，屠夫、屠宰场工人和肉品加工厂工人是猪链球菌在鼻咽部定居的高危人群。在新西兰，1980年以后的研究显示9%的奶牛场主、10%的肉品检验员及21%的猪场主对猪链球菌2型血清反应为阳性，表明一些人有亚临床感染。
4 检测方法
包括病原的分离鉴定方法及分子生物学方法、免疫学方法ELISA等。
4.1 分离鉴定方法
4.1.1 样品处理
取25g（或25mL）待检样品，加入225mL灭菌生理盐水，制成混悬液。
4.1.2 接种培养
吸取5mL混悬液接种至50mL葡萄糖肉浸液肉汤中，或直接划线于血平板上（如待检样品污染严重，可同时接种5mL至匹克氏肉汤中），36℃培养24h，接种于血平板上，36℃培养24h，挑起乙型溶血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，观察在液体和固体中的培养特征、溶血情况及革兰氏染色、形态，并进行环磷酸腺苷（CAMP）试验、链激酶试验和杆菌肽敏感试验。
4.1.3 CAMP试验
在血琼脂平板上用金黄色葡萄球菌培养物划一条直线，然后将链球菌培养物划一条线，与金黄色葡萄球菌培养物的划线相互垂直，但不要接触，二者相距3～5mm，各链球菌分离菌划线间距10～20mm。置37℃温箱内培养24h后观察结果。在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性。
4.1.4 链激酶试验
吸取草酸钾血浆0.2mL，加0.8mL灭菌生理盐水，混匀，再加入链球菌18～24h36℃肉浸液肉汤培养物0.5mL及0.25%氯化钙0.25mL，混匀，36℃水浴10min，血浆混合物自行凝固，观察凝块重新完全溶解的时间，完全溶解为阳性，如24h后不溶解即为阴性。同时用肉浸液肉汤做阴性对照，用已知的链激酶阳性的菌株做阳性对照。
4.1.5 杆菌肽敏感试验
取典型菌落的菌液涂布于血平板上，用灭菌镊子夹取每片含有0.04U的杆菌肽纸片置于上述平板上，36℃培养18～24h，如有抑菌圈出现即为阳性。用已知的阳性菌株做对照。
4.2 分子生物学方法
挑取单个可疑菌落接种于Luria-Bertani（LB）肉汤培养基中，37℃振荡培养过夜，取1.0mL菌悬液于1.5mL离心管中，用冷冻离心机12000r/min离心10min，弃去上清液，再加入1.0mL灭菌双蒸水，涡旋制成菌悬液，放入水浴锅中煮沸10min，3000r/min离心5min，以上清液为模板进行扩增。上游引物为：5′-GTACAGTTGCTTCAGGACGTATC-3′，下游引物为：5′-ACGTTCGATTTCATCACGTT-3′。反应体系：10×buffer5μL，TaqDNA聚合酶（5U/μL）1μL，MgCl2溶液（25mmol/L）3μL，dNTP（2.5mmol/L）4μL，上游引物（10μmol/L）1μL，下游引物（10μmol/L）1μL，模板5μL，用ddH2O补至50μL。反应条件：95℃预变性5min，94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸45s，共作用35个循环，72℃再延伸5min。PCR产物用1.5%的琼脂糖在100V条件下进行电泳，得到扩增长度为197bp的扩增产物为链球菌阳性。
4.3 ELISA
4.3.1 包被
用0.05mol/LpH9.0碳酸盐包被缓冲液，将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/mL。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1mL抗体，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3min（以下简称洗涤）。
4.3.2 加样
加一定稀释的菌液0.1mL于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1h。然后洗涤（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔）。
4.3.3 加酶标抗体
于各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1mL。37℃孵育0.5～1h，洗涤。
4.3.4 加底物液显色
于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1mL，37℃孵育10～30min。
4.3.5 终止反应
于各反应孔中加入2mol/L硫酸0.05mL。
4.3.6 结果判定
可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“＋”“－”号表示。也可测OD值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍即为阳性。
|
|
|
| 文章作者：曲志娜 赵思俊等 中国兽医发布 文章编辑：一米优讯 |
| 【进入社区】【进入专栏】【推荐朋友】【收藏此页】【大 中 小】【打印此文】【关闭窗口】 |
|
|
| 发表评论 (当前没有登录 [点击登录]) |
|
|
信息发布注意事项：
为维护网上公共秩序和社会稳定，请您自觉遵守以下条款：
一、不得利用本站危害国家安全、泄露国家秘密，不得侵犯国家社会集体的和公民的合法权益，不得利用本站制作、复制和传播下列信息：[查看详细]
（一）煽动抗拒、破坏宪法和法律、行政法规实施的；
（二）煽动颠覆国家政权，推翻社会主义制度的；
（三）煽动分裂国家、破坏国家统一的；
（四）煽动民族仇恨、民族歧视，破坏民族团结的；
（五）捏造或者歪曲事实，散布谣言，扰乱社会秩序的；
（六）宣扬封建迷信、淫秽、色情、赌博、暴力、凶杀、恐怖、教唆犯罪的；
（七）公然侮辱他人或者捏造事实诽谤他人的，或者进行其他恶意攻击的；
（八）损害国家机关信誉的；
（九）其他违反宪法和法律行政法规的；
（十）进行商业广告行为的。
二、互相尊重，对自己的言论和行为负责。
三、本网站不允许发布以下信息，网站编辑有权直接删除：[查看详细]
（一）、重复(恶意灌水)发布的信息；
（二）、在本栏目内发布例如供求信息、代理招商、会展、求职招聘等含有广告宣传性质、不符合网站栏目的信息内容；
（三）、与本网站主体定位不相关的信息等等。
四、本网站有权删除或锁定违反以上条款的会员账号以及该账号发布的所有信息。对情节恶劣的，本网将向相关机构举报及追究其法律责任！
五、对于违反上述条款的，本网将对该会员账号永久封禁。由此给该会员带来的损失由其全部承担！ |
|
|
| 声明：本网刊登的文章仅代表作者个人观点，文章内容仅供参考，并不构成投资建议，据此操作，风险自担。如果转载文章涉嫌侵犯您的著作权，或者转载出处出现错误，请及时联系文章编辑进行修正，电话：010-65283357。本网原创文章，转载请注明出处及作者。感谢您的支持和理解！ |
|
