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羊精液常温保存及影响因素
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2015/11/17 11:04:07 关注：471 评论： 我要投稿
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羊精液常温保存技术是羊人工授精技术过程中的关键环节。羊精液的常温保存，是指将羊精液稀释后，保存在15~25℃的环境中。随着对羊精液常温保存稀释液的探索，已由最初简便的生理盐水稀释液发展为使用葡萄糖、柠檬酸钠、卵黄及奶类等作为主要成分的常温保存稀释液，使羊精液的常温保存效果和受胎效果有了显著提高。另外，羊精液常温保存技术的使用不仅能够延长羊精液的有效保存时间，也能在一定范围内消除地域限制，提高母羊受胎效果，充分发挥优良种公羊的配种效能，扩大优秀种公羊精液的利用效率，并为羊人工授精，繁殖管理等技术的实施打下良好的基础。本文针对羊精液常温保存及影响因素加以综述，旨在对羊精液常温保存的研究提供一定的参考。
1羊精液常温保存原理及优点
由于羊精子的特殊性质，其对冷休克和冷冻刺激非常敏感，不适宜用冷冻保存。在实际生产中，对于羊精液的保存通常采用常温保存的方法。然而，在羊精液常温保存的过程中，受到多方面因素的影响，如稀释液pH、渗透压和稀释倍数等。因此，为了延长羊精子在体外的生存时间，需要通过在稀释液中添加化学抑制物或者降低保存温度来降低精子的新陈代谢，研究稀释液的组成及各组分的配比是羊精液常温保存技术的关键所在。
2羊精液常温保存稀释液成分
2.1 能源物质
糖类是羊精液常温保存稀释液中的重要能源物质，其主要功能是为羊精子提供营养和补充能量。另外，糖类能够稳定精子细胞膜蛋白质-脂类复合物，发挥保护精子细胞膜的作用。目前，稀释液中常用的糖类有：蔗糖、乳糖、果糖和葡萄糖，有研究表明，取其中两种糖混合使用的效果比单一使用一种糖的效果好。近些年来，稀释液中能源物质的创新和探索是羊精液常温保存技术的热点之一。例如在稀释液中添加10%的卵黄能够为羊精子提供营养。另外，卵黄中的低密度脂蛋白直接渗入原生质膜，能够起到稳定质膜的作用，发挥保护精子细胞膜的作用，从而显著提高保存后精子活率。
2.2 缓冲物质
在羊精液常温保存中，作为缓冲物质的有柠檬酸钠，碳酸氢钠和三羟基甲氨基甲烷（Tris）等，其中以Tris的效果最好。原因在于Tris具有良好的缓冲性和渗透性，并且高浓度的Tris对精子的毒性作用也较低。最新研究表明，在羊精液的常温保存中，与Tris相比，两性离子缓冲液能够更有效地保存羊精子。目前，较常用的缓冲物质为柠檬酸钠，在稀释液中添加3%的柠檬酸钠，其能够维持羊精液pH的相对稳定，降低稀释液pH变化过快给精子带来的不利影响。另有研究表明，卵黄中也含有渗透压缓冲物质，稀释液中由于卵黄的存在，能够使精子适应渗透压范围变化较大的稀释液。
2.3 抗菌物质及其他
羊精液在采集和保存过程中，难免会受到某些微生物的污染，在稀释液中添加适宜剂量的抗菌物质能够抑制细菌微生物的孳生，提高对有害细菌的杀灭能力，从而延长羊精子的存活时间。羊精液稀释液中使用抗生素的种类和剂量一般为青霉素1 000 U/mL；双氢链霉素1 000 μg/mL；硫酸庆大霉素100 U/mL。有研究表明将抗生素进行配伍使用往往能取得更好的抗菌效果。
近几年来，羊精液常温保存稀释液的配方研发有了很大创新。例如，在稀释液中加入明胶能够阻碍精子的运动，减少羊精子能量的消耗和活性氧的产生，达到延长保存时间的目的。在以乳汁为基础的稀释液中添加明胶和半胱氨酸，保存72 h之后，添加明胶组精子的活率可达到67%。用维生素B12液保存羊精子，可以使有效保存时间显著延长。另有研究表明用消过毒的脱脂鲜牛奶保存羊精液，可以大大提高羊精子的存活时间。由此可见，开发新型常温保存稀释液，能够有效提高羊精液常温保存的效果，同时，也是近几年来羊精液常温保存稀释液配方研究的热点。
3羊常温保存精液人工受胎效果
经常温保存后羊精液人工受胎的效果由输精方式和稀释液的保存效果共同决定。实际生产中，羊人工授精的输精方式有阴道输精和子宫颈口输精2种。由于阴道输精受胎率较低，在生产中通常使用的方法为子宫颈口输精。稀释液是羊精子在体外的生存环境，稀释液的保存效果直接影响到受胎率的高低。用高倍稀释精液进行人工授精，1只公羊1年可配种母羊10 000只以上，比本交提高200倍以上。经常温保存后羊精液的受胎率有了较大提高，对充分发挥优良种公羊的繁殖潜能起到了积极作用。用常温保存后的羊精液进行受胎率检测发现，进行输精处理组的母羊，未返情率可达66.67%~83.33%。以上结果表明，经过常温保存以后的羊精液具有良好的受精能力，能够在延长保存时间的同时，保证精液品质的合格，保证良好的受胎效果。
4影响羊精液常温保存效果的主要因素
影响羊精液常温保存效果的主要因素有保存温度、稀释液pH、活性氧族（ROS）产生的氧化损伤，以及精子细胞内外渗透压。
4.1 温度
精液从羊体内射出以后，精子生存环境的温度发生了变化。由于羊精子对温度变化非常敏感，适宜和恒定的保存温度是决定羊精液保存效果的关键因素。保存温度过高，精子的代谢活动加强，存活时间缩短；保存温度过低，会对精子造成低温打击，破坏精子的膜结构。与此同时，羊精液在进行稀释的过程中，应注意稀释液的温度，等温稀释能够有效防止由于突然降温造成羊精子冷休克的发生，对羊精子产生的应激最小。另外，稀释完毕以后，由于恒温箱中温度较低，不能立即将刚稀释过的羊精液放入恒温箱中，应将稀释完毕的精液在室温环境中静置，待温度降下来以后再放入恒温箱中。
4.2 PH稀释液
pH对于羊精子的保存有着至关重要的影响。羊精液略偏酸，pH通常在6.7到6.8之间。羊精液pH的大幅变化会导致精子结构的损伤，受胎率的下降，甚至精子的死亡。因此，为了在体外保持羊精子的活率和受精能力，控制稀释液的pH是非常重要的。精子在弱酸性环境中活动被抑制，消耗降低。因此，适度降低精液的pH，能够对精子的运动和新陈代谢产生抑制作用，减少精子的能量消耗，从而延长精子的有效保存时间。因此，在羊精液的常温保存过程中，适度降低稀释液pH，能够有效延长羊精子保存时间。同时，为了防止羊精液保存过程中pH的变化，在稀释液中需加入缓冲物质，如柠檬酸钠、酒石酸钾钠、磷酸二氢钾和三羟甲基甲烷（Tris）等，以提高羊精液常温保存的效果。例如，在稀释液中加入Tris，能使精液pH在一定程度上倾向于碱性，对稀释液pH有缓冲作用，维持精子的运动，有利于精子活率的提高。
4.3 氧化损伤
精子质膜完整性是精子新陈代谢、完成获能、顶体反应以及与透明带结合并穿过透明带的基础。精子质膜完整性和结构的损伤会导致精子活率的下降以及受胎率的降低。由于羊精子质膜的不饱和脂肪酸含量较高，在常温保存的过程中，易受到氧化反应造成的损伤。ROS是影响羊精液常温保存的重要因素。精子自身新陈代谢的过程中产生ROS，低浓度的ROS能够提高精子的活力和受精能力。然而，当ROS浓度超过精子的抗氧化能力范围时，会引起精子活率下降和细胞核内DNA损伤，同时引起精子受精能力的下降。因此，在稀释液中添加抗氧化物质能够有效降低氧化反应对羊精子的损伤。例如，在稀释液中加入适宜比例的牛血清白蛋白，能够有效降低ROS对于羊精子的氧化损伤，进而提高羊精子活率和质膜完整率。在稀释液中添加适量的牛磺酸，能降低脂质氧化反应对精子的损伤，从而有效抑制精子活力的下降和维持顶替完整。
4.4 渗透压
在羊精液常温保存的过程中，稀释倍数会对稀释后溶液的渗透压产生影响。对羊精液进行适宜倍数的稀释，能够起到稳定精子细胞膜内外渗透压的作用，提高羊精液常温保存的效果。精清中含有不利于精液保存的成分，适宜倍数的稀释能够使不利于精子保存的成分浓度降低，提高精子的保存效果。低分子量蛋白质，天然抗氧化剂等成分的浓度对于精子膜正常结构和功能的维持有着重要作用。
目前生产实践中常用注射用生理盐水或经过过滤消毒的0.9%氯化钠溶液做稀释液，但稀释倍数不宜过高，一般以2倍以下为宜。有研究表明，用葡萄糖-柠檬酸钠稀释液对羊精液进行3倍稀释，经常温保存12 h后，精子活力可达到30%。另外，精液经高倍稀释后，对精子的存活时间，活力等都会产生不良影响。一般输精最好不进行高倍稀释，这是由于高倍稀释会造成精子表面的膜发生变化，细胞的通透性增大，细胞内成分向外渗出，外界离子进入精子内部，给精子的代谢和生存带来不良影响。因此，稀释倍数的确定应依据实际情况而定，对于精子密度较大的精液样本，应适当提高稀释倍数，而对于精子密度较小的精液样本，应适当降低稀释倍数。
5小结羊精液常温保存是我国目前使用较为广泛的羊精液保存技术，在羊品种改良，提高种公羊利用率等方面具有良好的应用前景。目前，如何进一步延长羊精液的常温保存时间以及提高常温保存后羊精子的受精能力是现阶段羊精液常温保存研究的主要问题。新型羊精液常温保存稀释液的研发是此项技术发展的关键所在，通过对羊精液常温保存稀释液成分的探索以及成分的调节，显著提高常温保存后羊精子的受精能力，为提高种公羊利用效率和推动羊人工授精技术的发展奠定良好的基础。
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| 文章来源：中国畜牧杂志 文章作者：张小刚 文章编辑：现代畜牧网 |
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