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肠道不仅是体内最大的消化吸收器官，同时也是体内重要的免疫器官，生理功能完整的肠道粘膜对细菌和内毒素形成屏障。但是在应激状态下，大量的细菌和毒素穿过胃肠道进入宿主体内，降低肠粘膜上皮细胞的抵抗力、破坏紧密连接、损伤肠粘膜屏障。因此通过营养调控来增强动物的免疫机能和抗病能力，缓解氧化应激引起的肠道损伤，受到了越来越多学者的关注。益生菌(probiotics)是用来促进人和动物肠道微生物区系平衡的微生物制剂，能够调节肠道功能紊乱、维持肠道内菌群平衡并提高机体免疫水平，被广泛地应用于医药、食品、畜牧和水产等行业。目前国内外广泛应用的益生菌有芽孢杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌和酵母菌等，但大多数乳酸菌的抗胃酸、抗胆盐和抗高温能力差，而芽孢杆菌由于具有抗逆性强、耐高温高压、易贮藏等优点，成为益生菌中的研究热点。其中凝结芽孢杆菌作为一种能够形成芽孢的乳酸菌极具应用前景，凝结芽孢杆菌可形成芽孢、革兰氏阳性、兼性厌氧、杆状、可移动，在较宽温度（30~57°C）和pH值（4~10.5）范围内都能够生长。本试验旨在考察凝结芽孢杆菌对氧化应激白羽肉鸡肠道形态结构和肠粘膜免疫因子mRNA相对表达水平的影响，为凝结芽孢杆菌在实际中的应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1 试验设计
试验于2016年7月在青岛根源生物技术集团有限公司研发中心动物试验室进行，试验选择1日龄白羽肉鸡300羽，预饲7天，淘去体重差异大的鸡苗。剩余180羽肉鸡正式开始试验，试验分为3个处理组，每个处理组4个重复（即4个栏位），每个重复15只鸡，对照组和试验组1的饮水和日粮中不添加任何微生态制剂，试验组2饮水中添加凝结芽孢杆菌的终浓度为106 CFU/mL，在试验第21天，每个处理组随机选取4只鸡，试验组1和试验组2采用腹腔注射的方式注射敌草快（15 mg/kg体重，敌草快稀释浓度为15 mg/mL），敌草快是一种双吡啶除草剂，能够将单电子转移给氧形成自由基，可诱导肠道的氧化损伤，破坏肠道屏障并引起大量炎症因子的释放。对照组腹腔注射等量的生理盐水，注射24 h后对肉鸡进行屠宰并采样分析。
1.2 日粮组成及营养水平
试验所用饲料是根据白羽肉鸡不同时期营养需求制作的配合饲料，试验基础日粮组成和营养成分见表1。
2结果与分析
2.1 凝结芽孢杆菌对敌草快刺激空肠形态结构的影响
凝结芽孢杆菌对敌草快刺激空肠形态结构的影响如表3所示，试验组1的空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度均显著低于对照组（P<0.05），而隐窝深度显著高于对照组（P<0.05），说明敌草快破坏了空肠形态结构，对空肠形态造成了不利影响。试验组2的空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度均显著高于试验组1（P<0.05），表明攻毒后凝结芽孢杆菌有助于恢复空肠形态结构。
2.2 肉牛养殖投入
凝结芽孢杆菌对敌草快刺激白羽肉鸡血清抗氧化指标的影响如表4所示，试验组1的MDA含量显著高于对照组（P<0.05），而SOD含量显著低于对照组（P<0.05），说明敌草快攻毒后白羽肉鸡处于氧化应激状态。试验组2的MDA含量与试验组1没有显著性差异（P>0.05），SOD含量低于对照组但显著高于试验组1（P<0.05），说明凝结芽孢杆菌提高了攻毒后白羽肉鸡的抗氧化性能。
2.3 凝结芽孢杆菌对敌草快刺激白羽肉鸡空肠粘膜免疫因子mRNA相对表达量的影响
凝结芽孢杆菌对敌草快刺激白羽肉鸡空肠粘膜免疫因子mRNA相对表达量的影响如表5所示，攻毒后试验组1的致炎因子IL-1β、TNF-α、IFN-γ的mRNA相对表达水平显著高于对照组（P<0.05），而抑炎因子IL-10的mRNA相对表达水平显著低于对照组（P<0.05），说明攻毒后白羽肉鸡空肠粘膜中的致炎因子和抑炎因子mRNA表达失衡，致炎因子mRNA表达水平异常升高。试验组2粘膜中的抑炎因子IL-10的mRNA相对表达水平显著高于试验组1（P<0.05），而致炎因子IL-1β的mRNA相对表达水平显著低于试验组1（P<0.05），TNF-α、IFN-γ的mRNA相对表达水平与试验组1虽然没有显著性差异（P>0.05），但平均值均减小，表明凝结芽孢杆菌促进了致炎因子和抑炎因子的平衡。
攻毒后试验组1的TLR4和TLR5的mRNA相对表达水平显著高于对照组（P<0.05），而试验组2的TLR5的mRNA相对表达水平显著低于试验组1（P<0.05），表明凝结芽孢杆菌在一定程度上保护肠道屏障免受敌草快攻毒的影响。
3讨论
3.1 凝结芽孢杆菌对敌草快刺激空肠形态结构的影响
肠绒毛是小肠黏膜表面上皮和固有层向肠腔内伸出的细小突起，这种肠道形态结构增加了动物机体对营养物质吸收的吸收面积，小肠与营养物质相对接触面积就越大，对营养物质的吸收就越有利。本试验使用敌草快对白羽肉鸡进行攻毒，攻毒后白羽肉鸡的空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度均降低，而隐窝深度升高，说明敌草快破坏了空肠肠道形态结构。而饮水中添加凝结芽孢杆菌的试验组在攻毒后空肠绒毛高度、绒毛高度/隐窝深度均显著高于试验组1（P<0.05），说明凝结芽孢杆菌在一定程度上有利于空肠形态结构的恢复。
3.2 凝结芽孢杆菌对敌草快刺激白羽肉鸡血清抗氧化指标的影响
正常情况下，机体内的氧化和抗氧化系统处于平衡状态，机体产生的少量自由基会被体内的自由基清除酶（SOD，CAT，GSH-Px等）清除，但是在病理状态下，机体产生的过量自由基导致自由基清除酶被大量消耗，破坏了机体抗氧化防御能力，进而导致氧化应激。其中MDA是体内自由基通过脂质过氧化损害生物膜的终产物之一。MDA的含量与氧自由基的生成密切相关，因而测定MDA的含量可以反映出机体内的脂质过氧化程度，间接反映出细胞的损伤程度。而SOD能清除氧自由基，保护细胞免受氧化损伤，其活力的高低可间接反映出机体清除氧自由基的能力。本试验使用敌草快对白羽肉鸡进行攻毒，攻毒后白羽肉鸡的MDA含量升高，而SOD含量降低，说明攻毒使白羽肉鸡处于氧化应激状态。饮水中添加凝结芽孢杆菌的试验组在攻毒后提高了白羽肉鸡血清中SOD水平，说明凝结芽孢杆菌提高了攻毒后白羽肉鸡的抗氧化性能。
3.3 凝结芽孢杆菌对敌草快刺激白羽肉鸡空肠粘膜免疫因子mRNA相对表达量的影响
在动物发生免疫反应过程中会释放出各种导致肠道炎症反应的免疫因子和介质，包括促炎因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 和IL-17等，促炎因子与其它炎症细胞协同作用在抵御肠道病原菌入侵过程中发挥了重要作用。而抑炎因子IL-10和转化生长因子-β（TGF-β）具有免疫抑制功能，抑炎因子有多种免疫抑制功能，包括抑制巨噬细胞活化，抑制活性氧和氮中间代谢产物的生成，抑制致炎因子的生成，同时下调特异性免疫因子的生成（比如主要组织相容性复合物Ⅱ抗原呈递复合物和共刺激因子CD86）。正常情况下健康动物机体中的促炎症细胞因子和抑炎细胞因子处于动态平衡中，当动物发生肠道疾病时致炎因子和抑炎因子的动态平衡被打破，大量的炎症因子和趋化因子在病灶周围迅速增多，肠道炎症加重加快，肠道粘膜屏障就会受到严重破坏。本试验中白羽肉鸡攻毒后IL-1β、TNF-α、IFN-γ的mRNA相对表达水平升高，而抑炎因子IL-10的mRNA相对表达水平降低，说明攻毒造成了致炎因子和抑炎因子mRNA表达失衡，使动物机体处于炎症状态。饲喂凝结芽孢杆菌的试验组2与试验组1相比抑炎因子IL-10的mRNA相对表达水平显著升高（P<0.05），而IL-1β的mRNA相对表达水平显著降低（P<0.05），表明凝结芽孢杆菌降低了空肠粘膜内致炎因子的表达水平，促进了致炎因子和抑炎因子的平衡。
Toll样受体（Toll-like receptors, TLR）是参与非特异性免疫（天然免疫）的一类重要蛋白质分子，可以识别来源于微生物的具有保守结构的分子。当微生物突破机体的物理屏障，如皮肤、粘膜等时，TLR可以识别它们并激活机体产生免疫细胞应答。其中TLR4和TLR5分别可以识别革兰氏阴性菌脂多糖和细菌鞭毛蛋白。本试验中试验组1的TLR4和TLR5相对表达水平显著高于对照组（P<0.05），表明攻毒后肠道物理屏障被破坏，有大量的微生物侵入肠道上皮组织。试验组2的TLR5相对表达水平显著低于试验组1（P<0.05），表明凝结芽孢杆菌在一定程度上保护肠道屏障免受敌草快攻毒的影响。
4结论
在饮水中添加凝结芽孢杆菌可改善氧化应激对白羽肉鸡造成的氧化损伤，恢复空肠形态结构，并减少由氧化应激引起的致炎因子异常升高，维护肠道屏障功能。
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