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禽流感疫苗的种类与优缺点
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2011/9/20 12:08:36 关注：664 评论： 我要投稿
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禽流感是由A型禽流感病毒引起的一种家禽和野禽感染的疾病综合征。自1878年该病首次在意大利流行以来，不断蔓延，目前世界上许多国家和地区均有本病的暴发和流行。最近，2003年末至2004年初又在亚洲地区发生大规模流行。更令人担忧的是1997年在香港发生和2004年在越南发生的禽流感，突破了种间障碍直接感染人并引起死亡，因此打破了自然条件下仅有H1、H2、H3亚型禽流感可以感染人的常规，赋予了AIV全新的公共卫生意义。由于禽流感病毒(AIV)血清型众多，变异性强，给疫苗的研制带来极大的困难。油乳剂灭活疫苗由于自身的缺陷，特别是对疾病监控所产生的不利影响，只能用于禽流感暴发时的应急免疫，来减少经济损失，而不宜作常规免疫。亚单位疫苗制作成本较高，免疫期短，不可能成为预防禽流感的理想疫苗。对于核酸疫苗的研究也才刚刚起步，尚有许多问题有待解决。目前对表达HA基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗的研究较为深入，从多个角度分析这是一种较为理想的疫苗。这种基因工程疫苗的保护效率较高，又不干扰临床检测和检疫，是极有发展前途的一类抗AIV的基因工程疫苗，现在已在生产上被广泛使用。但是，同时也应注意到由于AIV血清型众多，疫苗的免疫效果与疫苗株和攻毒株的同源性密切相关，并且由于重组疫苗，特别是rFPV，受母源抗体的影响很大。如何克服这些缺点，使基因工程疫苗得到广泛的推广将是今后研究的重点。目前世界上几种主要禽流感疫苗及优缺点如下。
1全病毒灭活苗
全病毒灭活苗一般是用甲醛灭活禽流感病毒鸡胚增殖的尿囊液，辅以佐剂制成的油乳剂疫苗。全病毒灭活疫苗安全性好，抗原成分齐全，免疫原性强，不会出现毒力返强和变异的危险，能够经受同种亚型AIV的攻击，给免疫鸡群提供良好的免疫保护，也是目前被广泛应用的免疫疫苗。流感灭活疫苗便于储备，一旦确定AI暴发的病毒亚型，便可立即用于紧急预防接种，还可很方便地制备针对几种不同亚型病毒的多价疫苗，而且亚型抗原之间不产生免疫干扰。Swayne等用10株H5亚型和l株H7亚型AIV分离株分别制成油乳剂灭活苗，免疫4周龄SPF自来航鸡，3周后用HPAIVA/ ChickervQueretarod4588--1905(HSN2)攻毒，结果表明所有的10种H5AIV疫苗均能保护鸡免于发病和死亡，而H7AIV灭活苗则不能诱导机体产生抵抗H5 HPAlV攻击的保护力;免疫后病毒分离结果阳性，说明用这些灭活苗免疫只能保护鸡在同亚型HPAIV攻击时免于发病和死亡，而不能保护其免于感染。最近有研究表明，灭活的流感疫苗主要诱导小鼠的 Th2型免疫应答，对不同亚型的流感病毒无交叉保护作用。若在使用灭活苗的同时使用IL-12或IL-4的抗体，则可使 Th2型免疫应答选择性地向Thl型免疫应答转变，并能保护小鼠不受其他亚型流感病毒的攻击。这表明在用灭活苗免疫的同时若使用Thl型细胞因子，则可使机体产生对其他亚型的流感病毒的交叉保护力。利用细胞因子作为佐剂，对研究开发有跨亚型交叉保护作用的AI疫苗有一定的借鉴意义。对于灭活苗，目前使用的佐剂主要有：矿物油、动植物油、脂质体、Avridine、ISCOMs弗氏完全佐剂等。其中Aviridine是一种巨噬细胞激活凶子，具有诱导干扰素生成和增强细胞毒性 T淋巴细胞杀伤力的作用。
全病毒灭活疫苗能够诱导机体产生有效的免疫应答反应，并在以往发生禽流感的过程中，成为了一种为控制疫情的进一步蔓延与扩散、减少经济损失的有力武器。但其免疫效果是由注射剂量和疫苗中的抗原含量共同决定的，在进行免疫接种时往往需要比活疫苗高出许多倍的剂量，此外还必须添加佐剂，这就大大增加了灭活疫苗的成本。同时接种灭活疫苗的机体产生针对病毒内部蛋白(如NPl的特异性抗体，干扰了临床检测和检疫以及流行病学调查，这是以灭活苗防治AIV的最大障碍。为了解决这个问题，人们又开发了其它类型的AI疫苗。
2亚单位疫苗
亚单位疫苗是提取AIV具有免疫原性的蛋白，并辅以佐剂而制成的疫苗。这种疫苗具有良好的安全性，能刺激机体产生足够的免疫力，但免疫保护持续时间短，且制作的成本高。由于禽流感病毒的保护性抗原主要为HA和NA。HA糖蛋白和NA蛋白能够产生有保护作用的抗体，NP有种的特异性，能产生有保护作用的抗体和细胞免疫反应。1987年 Wraith用纯化的NP蛋白免疫小鼠，可保护小鼠免于流感病毒致死性感染。台湾谢快乐等用台湾AIV分离株fH8N4)的外膜蛋白HA和NA制作了免疫复合物亚单位疫苗，同时制作了灭活的油佐剂疫苗。用血凝抑制试验作为评价两种疫苗免疫效果的标准，结果表现差异不明显，只是在加强免疫时亚单位疫苗抗体升高比油佐剂苗明显。Kodihalli等用火鸡 H5N2病毒的HA和NP蛋白制备的亚单位复合疫苗免疫火鸡。在免疫后21d，火鸡产生高的HI抗体效价，并对同源或异源fH6N1)AIV的攻击产生抵抗力。美国蛋白质科学有限公司Bethanie和Wickinson等利用杆状病毒表达系统生产H5、 H7重组HA佐剂疫苗，用1日龄仔鸡作试验，对致死性禽流感强毒具有保护作用。
合成肽疫苗由于仅代表了蛋白抗原的一部分，很难象蛋白抗原疫苗一样诱导出多种免疫反应。又由于其通常不具备抗原蛋白上抗原表位所具有的构象和免疫原性弱，很难引起较强的免疫应答以获得长期的免疫力。重组抗原表位亚单位疫苗是将具有免疫保护作用的人工合成抗原肽结合到载体上，再加上佐剂制成的制剂，大大的增加了成本。同时，这种疫苗虽然具有良好的安全性，能刺激机体产生足够的免疫力，但免疫保护持续时间短，且制作的成本高等缺点。
3重组活载体疫苗
活载体基因重组疫苗是近年来十分关注的诸多新型疫苗中的一类，它是以利用基因工程方法改造的病毒或细菌作载体，按人们的要求表达特定免疫活性因子。PaolettiE于1982年将单纯疱疹病毒的TK基因通过共转染真核细胞培养物进行体内同源重组的方法构建了重组痘苗病毒，成功地探索了痘苗病毒作为真核表达载体的可行性。讫今为止痘苗病毒表达载体已广泛应用于表达各种生物学活性蛋白的表达及分析蛋白质的结构与功能等方面的研究。开发了许多新的载体疫苗。随着对AIV疫苗的深入研究，利用对禽类致病性很弱的痘苗病毒或禽痘病毒作载体，已进行大量构建表达 HA及其它保护性抗原的重组病毒疫苗的研究，已开发出了一些新的重组疫苗，其中一些已被有关国家已批准生产和使用。
1998年Barun等用牛痘病毒作载体构建含H5亚型血凝素基因的重组病毒，重组病毒在培养的细胞上增殖，然后将细胞裂解，制成油乳剂苗。免疫鸡后，能产生中和抗体和抵抗强毒的攻击。同年Thomasm等将A/TYAred370,83(H5N61株的HA基因插入含有痘病毒WR株TK基因的质粒pSCll中，通过同源重组获得Vac-H5重组病毒。用重组病毒免疫1日龄和5日龄的仔鸡，可对不同H5亚型的强毒株攻击产生近100%的保护。Chamber等也用痘病毒作为载体，构建了含有AIVA/TyAre0378,83(H5N8)HA基因的重组病毒。在体外培养的动物细胞上，该重组病毒可以表达完整的HA蛋白，且 HA可以裂解成HAl、HA2两部分。这表明HA的裂解并不依赖病毒的其它成分。HAl、HA2被转运到细胞表面，形成融膜蛋白。用该株重组病毒翅下刺种实验鸡，鸡体内可产生效价很低的HI抗体和中和抗体。然而它们可以保护免疫鸡抵抗强毒的攻击。但当法氏囊切除后，该重组病毒不能对免疫鸡群起保护作用。2002年，程坚等人把H9亚型禽流感病毒HA基因、鸡II型干扰素(IFN-II)基因分别置于痘苗病毒P7.5启动.子和鸡痘病毒早晚期启动子PFYL下游构建了共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡IFN-II的重组鸡痘病毒，动物试验表明，该重组病毒能显著抑制静脉攻毒后的1日龄SPF鸡及含母源抗体的商品鸡从泄殖腔排毒，并能减轻单表达HA的重组鸡痘病毒抑制1日龄SPA雏鸡增重的副作用。
多年来的研究也表明，病毒活载体疫苗具有长远的开发前景，生产成本低，便于免疫接种，类似于常规弱毒疫苗能真实地再现外源基因编码蛋白抗原性，能全方位地激发免疫应答反应;递呈免疫源的单一陛类似于亚单位疫苗，但不需要佐剂;免疫接种与自然感染动物可以应用特异性诊断试剂进行鉴别;最为重要的一点是FPV含有大量地复制非必需片段，可以供多种免疫源基因的插入，进而构建多价疫苗”。尽管如此，我们也不能不看到FPV载体的应用仍然存在着很多问题：一个好载体系统首选要求强启动子的采用以突破目前外源基因表达水平偏低的难关;同时外源基因插入的非必需基因也应优中选优;而目前我们对FPV的分子生物学背景了解还不够多，特别是其启动子结构和调控机制还不清楚;重组病毒的筛选方法还不够成熟;报告基因在动物体内的表达产物可能影响目的抗原的免疫原性;载体免疫和目的抗原的免疫存互相竞争等问题。
4核酸疫苗
核酸疫莳是最近几年新兴的一种疫苗，它是利用重组 DNA技术将保护性抗原蛋F_1基因克隆到真核表达载体，并将其直接导人体内，使抗原蛋白经过内源性表达递呈给免疫系统，诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。核酸免疫也称DNA免疫或基因免疫。用于免疫注射的质粒称为核酸疫苗fnucleic acid vaccine)或DNA疫苗fDNA vaccl’lle)。核酸疫苗不同于传统的弱毒苗、灭活苗及蛋白亚单位苗，它是带有特异抗原基因的真核表达质粒，具有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全方位免疫应答的能力，在防治病毒感染性疾病中有广阔的应用前景，已成为疫苗研究领域的热点之一。
核酸疫苗同其它常规疫苗相比具有下优点：f1)核酸免疫的抗原合成和递呈过程与病原的自然感染极相似，抗原具有蛋白经内源性合成后转运到细胞表面，通过MHC I和MHCⅡ分子递呈给免疫系统，同时诱导体液和细胞免疫反应。特别是特异性CD8+细胞毒淋巴细胞(cTI.)的免疫反应，这是灭活疫苗和一般亚单位疫苗不能比拟的。(2)核酸免疫只是输入含有抗原基因的表达质粒，只表达某一种或几种特异性蛋白质，不象常规的弱毒苗和灭活苗一样存在潜在感染的危险，也不象其它病毒载体引起机体对病毒本身的免疫反应。f3)对一些易于变异或较多血清型的病原体来说，进行多价疫苗研制较为困难，而克隆1个病原体的免疫原基因相对容易，可同时构建多种病原体基因的表达质粒。(4)核酸疫苗不需要在体外表达、纯化蛋白，因而相对省时省力。核酸疫苗易于构建和制备，稳定性好，贮存和运输相对方便，抗体持续时间长且免疫效果好，成本较低廉。(5)许多核酸疫苗只需1次注射，就可产生良好的免疫应答。
1993年Robinson等构建了用禽白血病病毒长末端重复序列启动AIV HA基因的表达性质粒。该质粒通过皮下、腹腔及静脉三种途径被导入鸡体内。首免100ng，只，一个月后加强免疫100ng/只，2～3周后攻击致死性强毒CKNIC/85 fH7N7)，剂量为100ELD50。结果是在首免和加强免疫后，Hl抗体和中和抗体滴度都很低，攻毒后抗体滴度明显上升，可产生100%的保护。Webster等最近用核酸疫苗免疫鸡来防治 H5、H7的实验证明，在H5亚型流感病毒之间，DNA疫苗的交叉保护性好，免疫后测不出抗体，而攻毒后出现高滴度的抗体，表明活化的T细胞是DNA介导免疫保护的主要机制。实验还证明骨骼肌注射是核酸疫苗免疫的最佳途径。
然而，核酸疫苗的研制和开发才刚刚起步，还有很多的关键性问题急待解决。第一，所用载体多带有抗生素基因，导致被免疫机体可能对相应的抗生素产生抗体，给一些常见的细菌性疾病的预防和治疗带来困难。第二，目前所研制的核酸疫苗体内表达效率不够高，免疫保护力不强，这可能与核酸疫苗在机体内的生存和表达有关，有可能进入机体的大部分质粒被机体当作异物降解，只有少部分得以残存和表达，或者是载体在动物体内表达效率不高，降低了核酸疫苗的免疫效果。
5反义基因工程疫苗
反义基因操作系统是近几年来刚刚兴起的分子生物技术新手段，其基本原理为：编码一个流感病毒节段的DNA质粒转录成负链的RNA，RNA与流感病毒粒PBI，PB2，PA和 NP一起孵育形成RNP复合物，RNP转染入流感助病毒 fhelper Virusl预先感染的细胞，采用适当的方法分离出带有转染节段的病毒，即转染子，从而获得流感病毒疫苗嘲。
反基因操纵子技术一建立，就开始应用于流感病毒疫苗，基因突变及结构与功能方面研究。如Muster等人用乙型流感病毒NS基因的非编码区，制备出了NA/B-NS转染子，亦即转染子NA基因的编码序列是甲型毒株的，而非编码序列是乙型毒株的。这种转染子能在组织培养细胞和鸡胚中生长，同时证实了在小鼠中是减毒的：又如Mafia等人用反基因操纵技术将毫无相关的外源基因插入A/WSN/33fHlNl)病毒NA基因上，分离出其NA基因含有外源基因的转染子 FL79.通过小鼠试验，证实了FL79转染子是减毒的。他们认为，外源基因插入编码区会引起病毒NA分子结构的改变，导致影响NA分子的稳定性，在细胞内的转运或四聚体形成，最终造成减毒。
Li等人将A/WSN/33(H1N1)毒株HA蛋白分子上抗原决定簇B位点上的6个氨基酸分别用A/Japan/57fH2N2)和A/ HongKong/8/68(H3N21毒株的所替代，制备出 w(H1)，.H2和w(H1).H3的转染子。血清学分析表明，无论用红细胞凝集抑制试验，还是中和方法测定，W(H1).H3转染子都能与WSN和 HK的抗血清起反应。用W(H1).H3转染子免疫小鼠，即可产生抗WSN，又能产生抗H3病毒的抗体。这些结果表明，反基因操纵技术，同样有可能用于流感病毒多价疫苗的制备。
在农业部和科技部共同主持及国家“973”、“863”和“攻关”项目资助下，具有国际先进水平的新型高效、重组禽流感病毒灭活疫苗fH5N1亚型)和禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的农业部动物流感重点开放实验室研制成功。该两种疫苗已通过农业部兽药审评委员会评审，获得农业部新兽药证书。
重组禽流感病毒灭活疫苗fH5N1亚型)突破了现阶段高致病力禽流感疫苗防制的技术瓶颈，与原有疫苗相比，抗原针对性更强，对鸡的有效免疫保护期更长，对鸭、鹅等水禽能够实现有效的免疫保护。在实验条件下对鸡的有效免疫保护长达10个月以上，比现有疫苗延长至少4个月。它的推广应用将为我国H5N1亚型高致病力禽流感的防制提供坚实的技术保障。重组禽流感病毒灭活疫苗fH5N1亚型)由高度致弱的H5N1亚型疫苗种子株制备。该疫苗种子株的研制采用了当前国际先进的流感疫苗株构建策略——流感病毒反向基因操作技术，其决定免疫保护原性的表面基因来自H5N1亚型高致病力禽流感流行株，并人工缺失了基因组中决定禽流感病毒高致病性的相关序列。该疫苗株对禽类和哺乳动物安全性高，具有高滴度鸡胚生长特性。
鸭、鹅等水禽是禽流感病毒重要的携带和储藏宿主，在高致病力禽流感病毒的变异和传播过程中扮演极为重要的角色，因此，水禽免疫是高致病力禽流感防制的关键环节。在实验条件下，鸭、鹅免疫新型H5N1灭活疫苗后3周，可完全抵御对H5N1高致病力禽流感病毒的攻击，不发病、不排毒、不死亡。大量现地试验进一步证实，该新型疫苗两次免疫后，可诱导鸭产生长达lO个月的有效免疫保护抗体反应，可诱导鹅产生3个月以上的有效免疫保护性抗体反应。在有效免疫保护期内，免疫鸭、鹅可抵御H5N1野毒感染侵袭，使鸭、鹅失去作为H5亚型高致病力禽流感病毒储藏宿主的能力。因此，新型疫苗对水禽的免疫将有效地切断高致病力禽流感病毒传播链的重要环节。目前，农业部已通知各有关省、自治区、直辖市兽医主管部门，在水网等重点地区对水禽免疫时，广泛使用重组禽流感病毒灭活疫苗。
H5N1亚型重组禽流感病毒灭活疫苗的成功研制克服了高致病性禽流感疫苗的研制技术瓶颈，同时解决了提高水禽禽流感免疫效果的技术难题。该疫苗是由高度致弱的H5N1亚型疫苗种子株制备而成。该疫苗种子株是采用当前国际先进的流感疫苗株构建策略——流感病毒反向基因操作技术，构建的一株与我国高致病力H5N1亚型禽流感病毒流行株抗原性一致、鸡胚增殖滴度高的低致病力禽流感病毒，其决定免疫保护原性的表面基因来自H5N1亚型高致病力禽流感流行株，并人工缺失了基因组中决定禽流感病毒高致病性的相关序列。以这一病毒为种毒研制的禽流感灭活疫苗对禽类和哺乳动物高度安全，抗原针对性强，免疫效力高，对鸡的有效免疫保护期长达10个月以上。由于鸭、鹅等水禽是禽流感病毒重要的携带和储藏宿主，所以在高致病力禽流感病毒的变异和传播过程中，扮演着极为重要的角色。因此，水禽免疫是防制高致病性禽流感的关键环节。大量实验室和现地试验证实，接种该新型疫苗后，对水禽可提供有效保护，从而切断禽流感病毒通过水禽向家禽及哺乳动物和人类传播的传播链。
H5亚型禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗系以高度成熟安全的鸡痘病毒为载体研制的新型基因工程禽流感一鸡痘二联疫苗。该疫苗毒株的研制是采用重组DNA技术，将我国 H5N1亚型禽流感病毒早期分离株的两个基因同源重组到鸡痘病毒疫苗株的基因组中，构建了重组鸡痘病毒。动物试验结果表明，该重组鸡痘疫苗免疫后9个月内，对H5N1亚型高致病力禽流感病毒的致死性攻击均可提供完伞保护。与全病毒灭活疫苗相比，该基因工程疫苗抗原针对性强，免疫接种后不产生针对流感病毒核蛋白的抗体，不影响疫情监测，具有安全、高效、免疫效力产生快、免疫保护期长及免疫接种成本低等突出特点。同时该疫苗的应用还可有效预防鸡痘的发生，达到“一针多防”的效果。该疫苗不含佐剂，免疫肉鸡后不影响肉质，具有高度食品安全性，显示了良好的应用前景。
6表达H5亚型高致病力禽流感病毒抗原基因的重组新城疫病毒活载体双价疫苗
世界动物卫生组织规定的A类传染病中，只包括两种禽类烈性传染病，分别为高致病性禽流感和新城疫。高致病性禽流感同时具有极其重要的公共卫生意义，H5亚型高致病性禽流感的防控已经成为国际社会面临的巨大挑战。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所f国家禽流感参考实验室)的科研人员选择我国自行培育、免疫效果良好的一株新城疫病毒弱毒疫苗为载体，采用国际先进的反向基因操作技术，经过近四年努力，在国际上首次研制了表达H5亚型高致病力禽流感病毒抗原基因的重组新城疫病毒活载体双价疫苗。新型疫苗与现有疫苗相比具有巨大优越性：一是可以实现一次免疫即可预防高致病性流感和新城疫两种重大禽病。由于我国新城疫疫情复杂，发病死亡率高，对养禽业造成的损失巨大，新生雏鸡都要进行新城疫免疫，每年使用新城疫疫苗在一百亿羽份以上。新型疫苗推广使用后，可以使高致病性禽流感和新城疫的免疫一次完成。二是安全性更高、使用更方便。该疫苗对新生雏鸡副反应小，不会引起死亡;不仅可以通过注射方式使用，还可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼等多种方式免疫，使免疫T作大为简单、方便、快捷，可以大幅度提高免疫效率，提高免疫密度，提高免疫质量。三是更适用于肉禽的免疫。使用新型疫苗，雏禽1日龄即可免疫，短期内就能形成有效保护，而且对肉质不会产生任何影响，适合在肉禽饲养企业推广使用。四是生产成本低廉，可以有效节约防疫经费?预计这种新型疫苗批量牛产的成本仅为现有疫苗的五分之一左右。
禽流感疫苗的种类与优缺点
禽流感是由A型禽流感病毒引起的一种家禽和野禽感染的疾病综合征。自1878年该病首次在意大利流行以来，不断蔓延，目前世界上许多国家和地区均有本病的暴发和流行。最近，2003年末至2004年初又在亚洲地区发生大规模流行。更令人担忧的是1997年在香港发生和2004年在越南发生的禽流感，突破了种间障碍直接感染人并引起死亡，因此打破了自然条件下仅有H1、H2、H3亚型禽流感可以感染人的常规，赋予了AIV全新的公共卫生意义。由于禽流感病毒(AIV)血清型众多，变异性强，给疫苗的研制带来极大的困难。油乳剂灭活疫苗由于自身的缺陷，特别是对疾病监控所产生的不利影响，只能用于禽流感暴发时的应急免疫，来减少经济损失，而不宜作常规免疫。亚单位疫苗制作成本较高，免疫期短，不可能成为预防禽流感的理想疫苗。对于核酸疫苗的研究也才刚刚起步，尚有许多问题有待解决。目前对表达HA基因的重组鸡痘病毒活载体疫苗的研究较为深入，从多个角度分析这是一种较为理想的疫苗。这种基因工程疫苗的保护效率较高，又不干扰临床检测和检疫，是极有发展前途的一类抗AIV的基因工程疫苗，现在已在生产上被广泛使用。但是，同时也应注意到由于AIV血清型众多，疫苗的免疫效果与疫苗株和攻毒株的同源性密切相关，并且由于重组疫苗，特别是rFPV，受母源抗体的影响很大。如何克服这些缺点，使基因工程疫苗得到广泛的推广将是今后研究的重点。目前世界上几种主要禽流感疫苗及优缺点如下。
1全病毒灭活苗
全病毒灭活苗一般是用甲醛灭活禽流感病毒鸡胚增殖的尿囊液，辅以佐剂制成的油乳剂疫苗。全病毒灭活疫苗安全性好，抗原成分齐全，免疫原性强，不会出现毒力返强和变异的危险，能够经受同种亚型AIV的攻击，给免疫鸡群提供良好的免疫保护，也是目前被广泛应用的免疫疫苗。流感灭活疫苗便于储备，一旦确定AI暴发的病毒亚型，便可立即用于紧急预防接种，还可很方便地制备针对几种不同亚型病毒的多价疫苗，而且亚型抗原之间不产生免疫干扰。Swayne等用10株H5亚型和l株H7亚型AIV分离株分别制成油乳剂灭活苗，免疫4周龄SPF自来航鸡，3周后用HPAIVA/ ChickervQueretarod4588--1905(HSN2)攻毒，结果表明所有的10种H5AIV疫苗均能保护鸡免于发病和死亡，而H7AIV灭活苗则不能诱导机体产生抵抗H5 HPAlV攻击的保护力;免疫后病毒分离结果阳性，说明用这些灭活苗免疫只能保护鸡在同亚型HPAIV攻击时免于发病和死亡，而不能保护其免于感染。最近有研究表明，灭活的流感疫苗主要诱导小鼠的 Th2型免疫应答，对不同亚型的流感病毒无交叉保护作用。若在使用灭活苗的同时使用IL-12或IL-4的抗体，则可使 Th2型免疫应答选择性地向Thl型免疫应答转变，并能保护小鼠不受其他亚型流感病毒的攻击。这表明在用灭活苗免疫的同时若使用Thl型细胞因子，则可使机体产生对其他亚型的流感病毒的交叉保护力。利用细胞因子作为佐剂，对研究开发有跨亚型交叉保护作用的AI疫苗有一定的借鉴意义。对于灭活苗，目前使用的佐剂主要有：矿物油、动植物油、脂质体、Avridine、ISCOMs弗氏完全佐剂等。其中Aviridine是一种巨噬细胞激活凶子，具有诱导干扰素生成和增强细胞毒性 T淋巴细胞杀伤力的作用。
全病毒灭活疫苗能够诱导机体产生有效的免疫应答反应，并在以往发生禽流感的过程中，成为了一种为控制疫情的进一步蔓延与扩散、减少经济损失的有力武器。但其免疫效果是由注射剂量和疫苗中的抗原含量共同决定的，在进行免疫接种时往往需要比活疫苗高出许多倍的剂量，此外还必须添加佐剂，这就大大增加了灭活疫苗的成本。同时接种灭活疫苗的机体产生针对病毒内部蛋白(如NPl的特异性抗体，干扰了临床检测和检疫以及流行病学调查，这是以灭活苗防治AIV的最大障碍。为了解决这个问题，人们又开发了其它类型的AI疫苗。
2亚单位疫苗
亚单位疫苗是提取AIV具有免疫原性的蛋白，并辅以佐剂而制成的疫苗。这种疫苗具有良好的安全性，能刺激机体产生足够的免疫力，但免疫保护持续时间短，且制作的成本高。由于禽流感病毒的保护性抗原主要为HA和NA。HA糖蛋白和NA蛋白能够产生有保护作用的抗体，NP有种的特异性，能产生有保护作用的抗体和细胞免疫反应。1987年 Wraith用纯化的NP蛋白免疫小鼠，可保护小鼠免于流感病毒致死性感染。台湾谢快乐等用台湾AIV分离株fH8N4)的外膜蛋白HA和NA制作了免疫复合物亚单位疫苗，同时制作了灭活的油佐剂疫苗。用血凝抑制试验作为评价两种疫苗免疫效果的标准，结果表现差异不明显，只是在加强免疫时亚单位疫苗抗体升高比油佐剂苗明显。Kodihalli等用火鸡 H5N2病毒的HA和NP蛋白制备的亚单位复合疫苗免疫火鸡。在免疫后21d，火鸡产生高的HI抗体效价，并对同源或异源fH6N1)AIV的攻击产生抵抗力。美国蛋白质科学有限公司Bethanie和Wickinson等利用杆状病毒表达系统生产H5、 H7重组HA佐剂疫苗，用1日龄仔鸡作试验，对致死性禽流感强毒具有保护作用。
合成肽疫苗由于仅代表了蛋白抗原的一部分，很难象蛋白抗原疫苗一样诱导出多种免疫反应。又由于其通常不具备抗原蛋白上抗原表位所具有的构象和免疫原性弱，很难引起较强的免疫应答以获得长期的免疫力。重组抗原表位亚单位疫苗是将具有免疫保护作用的人工合成抗原肽结合到载体上，再加上佐剂制成的制剂，大大的增加了成本。同时，这种疫苗虽然具有良好的安全性，能刺激机体产生足够的免疫力，但免疫保护持续时间短，且制作的成本高等缺点。
3重组活载体疫苗
活载体基因重组疫苗是近年来十分关注的诸多新型疫苗中的一类，它是以利用基因工程方法改造的病毒或细菌作载体，按人们的要求表达特定免疫活性因子。PaolettiE于1982年将单纯疱疹病毒的TK基因通过共转染真核细胞培养物进行体内同源重组的方法构建了重组痘苗病毒，成功地探索了痘苗病毒作为真核表达载体的可行性。讫今为止痘苗病毒表达载体已广泛应用于表达各种生物学活性蛋白的表达及分析蛋白质的结构与功能等方面的研究。开发了许多新的载体疫苗。随着对AIV疫苗的深入研究，利用对禽类致病性很弱的痘苗病毒或禽痘病毒作载体，已进行大量构建表达 HA及其它保护性抗原的重组病毒疫苗的研究，已开发出了一些新的重组疫苗，其中一些已被有关国家已批准生产和使用。
1998年Barun等用牛痘病毒作载体构建含H5亚型血凝素基因的重组病毒，重组病毒在培养的细胞上增殖，然后将细胞裂解，制成油乳剂苗。免疫鸡后，能产生中和抗体和抵抗强毒的攻击。同年Thomasm等将A/TYAred370,83(H5N61株的HA基因插入含有痘病毒WR株TK基因的质粒pSCll中，通过同源重组获得Vac-H5重组病毒。用重组病毒免疫1日龄和5日龄的仔鸡，可对不同H5亚型的强毒株攻击产生近100%的保护。Chamber等也用痘病毒作为载体，构建了含有AIVA/TyAre0378,83(H5N8)HA基因的重组病毒。在体外培养的动物细胞上，该重组病毒可以表达完整的HA蛋白，且 HA可以裂解成HAl、HA2两部分。这表明HA的裂解并不依赖病毒的其它成分。HAl、HA2被转运到细胞表面，形成融膜蛋白。用该株重组病毒翅下刺种实验鸡，鸡体内可产生效价很低的HI抗体和中和抗体。然而它们可以保护免疫鸡抵抗强毒的攻击。但当法氏囊切除后，该重组病毒不能对免疫鸡群起保护作用。2002年，程坚等人把H9亚型禽流感病毒HA基因、鸡II型干扰素(IFN-II)基因分别置于痘苗病毒P7.5启动.子和鸡痘病毒早晚期启动子PFYL下游构建了共表达H9亚型禽流感病毒HA和鸡IFN-II的重组鸡痘病毒，动物试验表明，该重组病毒能显著抑制静脉攻毒后的1日龄SPF鸡及含母源抗体的商品鸡从泄殖腔排毒，并能减轻单表达HA的重组鸡痘病毒抑制1日龄SPA雏鸡增重的副作用。
多年来的研究也表明，病毒活载体疫苗具有长远的开发前景，生产成本低，便于免疫接种，类似于常规弱毒疫苗能真实地再现外源基因编码蛋白抗原性，能全方位地激发免疫应答反应;递呈免疫源的单一陛类似于亚单位疫苗，但不需要佐剂;免疫接种与自然感染动物可以应用特异性诊断试剂进行鉴别;最为重要的一点是FPV含有大量地复制非必需片段，可以供多种免疫源基因的插入，进而构建多价疫苗”。尽管如此，我们也不能不看到FPV载体的应用仍然存在着很多问题：一个好载体系统首选要求强启动子的采用以突破目前外源基因表达水平偏低的难关;同时外源基因插入的非必需基因也应优中选优;而目前我们对FPV的分子生物学背景了解还不够多，特别是其启动子结构和调控机制还不清楚;重组病毒的筛选方法还不够成熟;报告基因在动物体内的表达产物可能影响目的抗原的免疫原性;载体免疫和目的抗原的免疫存互相竞争等问题。
4核酸疫苗
核酸疫莳是最近几年新兴的一种疫苗，它是利用重组 DNA技术将保护性抗原蛋F_1基因克隆到真核表达载体，并将其直接导人体内，使抗原蛋白经过内源性表达递呈给免疫系统，诱导机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫反应。核酸免疫也称DNA免疫或基因免疫。用于免疫注射的质粒称为核酸疫苗fnucleic acid vaccine)或DNA疫苗fDNA vaccl’lle)。核酸疫苗不同于传统的弱毒苗、灭活苗及蛋白亚单位苗，它是带有特异抗原基因的真核表达质粒，具有重组亚单位疫苗的安全性和减毒活疫苗诱导全方位免疫应答的能力，在防治病毒感染性疾病中有广阔的应用前景，已成为疫苗研究领域的热点之一。
核酸疫苗同其它常规疫苗相比具有下优点：f1)核酸免疫的抗原合成和递呈过程与病原的自然感染极相似，抗原具有蛋白经内源性合成后转运到细胞表面，通过MHC I和MHCⅡ分子递呈给免疫系统，同时诱导体液和细胞免疫反应。特别是特异性CD8+细胞毒淋巴细胞(cTI.)的免疫反应，这是灭活疫苗和一般亚单位疫苗不能比拟的。(2)核酸免疫只是输入含有抗原基因的表达质粒，只表达某一种或几种特异性蛋白质，不象常规的弱毒苗和灭活苗一样存在潜在感染的危险，也不象其它病毒载体引起机体对病毒本身的免疫反应。f3)对一些易于变异或较多血清型的病原体来说，进行多价疫苗研制较为困难，而克隆1个病原体的免疫原基因相对容易，可同时构建多种病原体基因的表达质粒。(4)核酸疫苗不需要在体外表达、纯化蛋白，因而相对省时省力。核酸疫苗易于构建和制备，稳定性好，贮存和运输相对方便，抗体持续时间长且免疫效果好，成本较低廉。(5)许多核酸疫苗只需1次注射，就可产生良好的免疫应答。
1993年Robinson等构建了用禽白血病病毒长末端重复序列启动AIV HA基因的表达性质粒。该质粒通过皮下、腹腔及静脉三种途径被导入鸡体内。首免100ng，只，一个月后加强免疫100ng/只，2～3周后攻击致死性强毒CKNIC/85 fH7N7)，剂量为100ELD50。结果是在首免和加强免疫后，Hl抗体和中和抗体滴度都很低，攻毒后抗体滴度明显上升，可产生100%的保护。Webster等最近用核酸疫苗免疫鸡来防治 H5、H7的实验证明，在H5亚型流感病毒之间，DNA疫苗的交叉保护性好，免疫后测不出抗体，而攻毒后出现高滴度的抗体，表明活化的T细胞是DNA介导免疫保护的主要机制。实验还证明骨骼肌注射是核酸疫苗免疫的最佳途径。
然而，核酸疫苗的研制和开发才刚刚起步，还有很多的关键性问题急待解决。第一，所用载体多带有抗生素基因，导致被免疫机体可能对相应的抗生素产生抗体，给一些常见的细菌性疾病的预防和治疗带来困难。第二，目前所研制的核酸疫苗体内表达效率不够高，免疫保护力不强，这可能与核酸疫苗在机体内的生存和表达有关，有可能进入机体的大部分质粒被机体当作异物降解，只有少部分得以残存和表达，或者是载体在动物体内表达效率不高，降低了核酸疫苗的免疫效果。
5反义基因工程疫苗
反义基因操作系统是近几年来刚刚兴起的分子生物技术新手段，其基本原理为：编码一个流感病毒节段的DNA质粒转录成负链的RNA，RNA与流感病毒粒PBI，PB2，PA和 NP一起孵育形成RNP复合物，RNP转染入流感助病毒 fhelper Virusl预先感染的细胞，采用适当的方法分离出带有转染节段的病毒，即转染子，从而获得流感病毒疫苗嘲。
反基因操纵子技术一建立，就开始应用于流感病毒疫苗，基因突变及结构与功能方面研究。如Muster等人用乙型流感病毒NS基因的非编码区，制备出了NA/B-NS转染子，亦即转染子NA基因的编码序列是甲型毒株的，而非编码序列是乙型毒株的。这种转染子能在组织培养细胞和鸡胚中生长，同时证实了在小鼠中是减毒的：又如Mafia等人用反基因操纵技术将毫无相关的外源基因插入A/WSN/33fHlNl)病毒NA基因上，分离出其NA基因含有外源基因的转染子 FL79.通过小鼠试验，证实了FL79转染子是减毒的。他们认为，外源基因插入编码区会引起病毒NA分子结构的改变，导致影响NA分子的稳定性，在细胞内的转运或四聚体形成，最终造成减毒。
Li等人将A/WSN/33(H1N1)毒株HA蛋白分子上抗原决定簇B位点上的6个氨基酸分别用A/Japan/57fH2N2)和A/ HongKong/8/68(H3N21毒株的所替代，制备出 w(H1)，.H2和w(H1).H3的转染子。血清学分析表明，无论用红细胞凝集抑制试验，还是中和方法测定，W(H1).H3转染子都能与WSN和 HK的抗血清起反应。用W(H1).H3转染子免疫小鼠，即可产生抗WSN，又能产生抗H3病毒的抗体。这些结果表明，反基因操纵技术，同样有可能用于流感病毒多价疫苗的制备。
在农业部和科技部共同主持及国家“973”、“863”和“攻关”项目资助下，具有国际先进水平的新型高效、重组禽流感病毒灭活疫苗fH5N1亚型)和禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的农业部动物流感重点开放实验室研制成功。该两种疫苗已通过农业部兽药审评委员会评审，获得农业部新兽药证书。
重组禽流感病毒灭活疫苗fH5N1亚型)突破了现阶段高致病力禽流感疫苗防制的技术瓶颈，与原有疫苗相比，抗原针对性更强，对鸡的有效免疫保护期更长，对鸭、鹅等水禽能够实现有效的免疫保护。在实验条件下对鸡的有效免疫保护长达10个月以上，比现有疫苗延长至少4个月。它的推广应用将为我国H5N1亚型高致病力禽流感的防制提供坚实的技术保障。重组禽流感病毒灭活疫苗fH5N1亚型)由高度致弱的H5N1亚型疫苗种子株制备。该疫苗种子株的研制采用了当前国际先进的流感疫苗株构建策略——流感病毒反向基因操作技术，其决定免疫保护原性的表面基因来自H5N1亚型高致病力禽流感流行株，并人工缺失了基因组中决定禽流感病毒高致病性的相关序列。该疫苗株对禽类和哺乳动物安全性高，具有高滴度鸡胚生长特性。
鸭、鹅等水禽是禽流感病毒重要的携带和储藏宿主，在高致病力禽流感病毒的变异和传播过程中扮演极为重要的角色，因此，水禽免疫是高致病力禽流感防制的关键环节。在实验条件下，鸭、鹅免疫新型H5N1灭活疫苗后3周，可完全抵御对H5N1高致病力禽流感病毒的攻击，不发病、不排毒、不死亡。大量现地试验进一步证实，该新型疫苗两次免疫后，可诱导鸭产生长达lO个月的有效免疫保护抗体反应，可诱导鹅产生3个月以上的有效免疫保护性抗体反应。在有效免疫保护期内，免疫鸭、鹅可抵御H5N1野毒感染侵袭，使鸭、鹅失去作为H5亚型高致病力禽流感病毒储藏宿主的能力。因此，新型疫苗对水禽的免疫将有效地切断高致病力禽流感病毒传播链的重要环节。目前，农业部已通知各有关省、自治区、直辖市兽医主管部门，在水网等重点地区对水禽免疫时，广泛使用重组禽流感病毒灭活疫苗。
H5N1亚型重组禽流感病毒灭活疫苗的成功研制克服了高致病性禽流感疫苗的研制技术瓶颈，同时解决了提高水禽禽流感免疫效果的技术难题。该疫苗是由高度致弱的H5N1亚型疫苗种子株制备而成。该疫苗种子株是采用当前国际先进的流感疫苗株构建策略——流感病毒反向基因操作技术，构建的一株与我国高致病力H5N1亚型禽流感病毒流行株抗原性一致、鸡胚增殖滴度高的低致病力禽流感病毒，其决定免疫保护原性的表面基因来自H5N1亚型高致病力禽流感流行株，并人工缺失了基因组中决定禽流感病毒高致病性的相关序列。以这一病毒为种毒研制的禽流感灭活疫苗对禽类和哺乳动物高度安全，抗原针对性强，免疫效力高，对鸡的有效免疫保护期长达10个月以上。由于鸭、鹅等水禽是禽流感病毒重要的携带和储藏宿主，所以在高致病力禽流感病毒的变异和传播过程中，扮演着极为重要的角色。因此，水禽免疫是防制高致病性禽流感的关键环节。大量实验室和现地试验证实，接种该新型疫苗后，对水禽可提供有效保护，从而切断禽流感病毒通过水禽向家禽及哺乳动物和人类传播的传播链。
H5亚型禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗系以高度成熟安全的鸡痘病毒为载体研制的新型基因工程禽流感一鸡痘二联疫苗。该疫苗毒株的研制是采用重组DNA技术，将我国 H5N1亚型禽流感病毒早期分离株的两个基因同源重组到鸡痘病毒疫苗株的基因组中，构建了重组鸡痘病毒。动物试验结果表明，该重组鸡痘疫苗免疫后9个月内，对H5N1亚型高致病力禽流感病毒的致死性攻击均可提供完伞保护。与全病毒灭活疫苗相比，该基因工程疫苗抗原针对性强，免疫接种后不产生针对流感病毒核蛋白的抗体，不影响疫情监测，具有安全、高效、免疫效力产生快、免疫保护期长及免疫接种成本低等突出特点。同时该疫苗的应用还可有效预防鸡痘的发生，达到“一针多防”的效果。该疫苗不含佐剂，免疫肉鸡后不影响肉质，具有高度食品安全性，显示了良好的应用前景。
6表达H5亚型高致病力禽流感病毒抗原基因的重组新城疫病毒活载体双价疫苗
世界动物卫生组织规定的A类传染病中，只包括两种禽类烈性传染病，分别为高致病性禽流感和新城疫。高致病性禽流感同时具有极其重要的公共卫生意义，H5亚型高致病性禽流感的防控已经成为国际社会面临的巨大挑战。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所f国家禽流感参考实验室)的科研人员选择我国自行培育、免疫效果良好的一株新城疫病毒弱毒疫苗为载体，采用国际先进的反向基因操作技术，经过近四年努力，在国际上首次研制了表达H5亚型高致病力禽流感病毒抗原基因的重组新城疫病毒活载体双价疫苗。新型疫苗与现有疫苗相比具有巨大优越性：一是可以实现一次免疫即可预防高致病性流感和新城疫两种重大禽病。由于我国新城疫疫情复杂，发病死亡率高，对养禽业造成的损失巨大，新生雏鸡都要进行新城疫免疫，每年使用新城疫疫苗在一百亿羽份以上。新型疫苗推广使用后，可以使高致病性禽流感和新城疫的免疫一次完成。二是安全性更高、使用更方便。该疫苗对新生雏鸡副反应小，不会引起死亡;不仅可以通过注射方式使用，还可通过饮水、喷雾、滴鼻、点眼等多种方式免疫，使免疫T作大为简单、方便、快捷，可以大幅度提高免疫效率，提高免疫密度，提高免疫质量。三是更适用于肉禽的免疫。使用新型疫苗，雏禽1日龄即可免疫，短期内就能形成有效保护，而且对肉质不会产生任何影响，适合在肉禽饲养企业推广使用。四是生产成本低廉，可以有效节约防疫经费?预计这种新型疫苗批量牛产的成本仅为现有疫苗的五分之一左右。
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