HBD曾祖代鸡支原体净化状态的维持和检测

现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2018/3/29 17:51:39 关注：1221 评论： 我要投稿

摘要：山东益生种畜禽公司于2016年从法国引进4000套哈伯德白羽肉鸡曾祖代鸡，鉴于国内鸡群的支原体感染率较高，为保障曾祖代鸡群的阴性状态，单独设计了严格的生物安全隔离与多项控制措施，并持续进行血清学和病原学跟踪监测评估。曾祖代种鸡群没有免疫MS疫苗，监测内容包含MS血清抗体和种鸡咽喉拭子的MS病原；而MG使用弱毒和灭活疫苗，无法用血清抗体和种鸡咽喉拭子评估感染状态，而采用PCR方法检测后代雏鸡和孵化后啄壳死亡毛蛋的气囊拭子评估MG感染。[admin1] 从1w-58w共采集血清19次，合计1140份样品，结果显示MS抗体检测均为阴性。在4w-58w期间，2个鸡舍共采集14次，合计840份咽喉棉拭子，PCR扩增MS病原均为阴性。为了评估MS和MG的垂直传播，采集和观察30w-55w期间9批270只1日龄的后代雏鸡气囊，同时采集后代孵化后啄壳死亡的313枚毛蛋的气囊，雏鸡和毛蛋均未发现气囊浑浊现象，MS和MGPCR检测也均为阴性。在整个约60周的生产周期中鸡群一直保持了禽滑液囊支原体（MS）支原体和鸡毒支原体（MG)无感染状态[admin2] 。结果表明，在我国的条件下，只要采取严格的生物安全隔离预防措施，种鸡群也是完全可以实现并维持MS和MG净化状态。

关键词：HBD曾祖代；MS ；MG；净化

支原体感染是鸡群中普遍存在的一种感染，在大型养殖公司的集约化饲养的鸡群，支原体感染尤为严重。对鸡群有明显致病性的支原体主要有二种，即鸡滑液囊支原体（MS)和鸡毒支原体(MG)。鸡滑液囊支原体病是由鸡滑液囊支原体（MS）引起鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、鸽等的一种以关节渗出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎为特征的急性或慢性传染性疾病，引起上呼吸道疾病、降低产蛋量、蛋品质以及孵化率，导致生长迟缓和饲料转化率降低，降低屠宰时胴体质量，使屠体废弃率升高[1,2] 。鸡毒支原体（MG）感染鸡只又称为鸡慢性呼吸道病（CRD），临床病程很长，发展缓慢。该病的临床症状主要表现为：呼吸啰音、咳嗽、流鼻涕、结膜炎。其中以鸡毒支原体是致病性最强，引起经济损失最大的家禽支原体病[2]。MS和MG既能在鸡群内横向感染，也能通过鸡胚垂直感染，而且在新购进的雏鸡中一旦带有少量经垂直传染的个体，很容易在育雏阶段就在全群迅速传播开来[1]。因此，保持种鸡群的无MS和MG感染状态，是种鸡及其提供的苗鸡的最重要的质量指标之一。近年来，随着疫苗使用技术的不断改进和种源禽白血病净化示范成功推广，禽流感、新城疫、传染性法氏囊病、马立克氏病及禽白血病均得到了有效控制。然而，我国鸡群中支原体感染的问题日益突出，一些发病严重的蛋鸡场甚至开始追究种鸡公司的责任。因此，国内种鸡公司在控制支原体感染方面面对市场越来越大的压力。虽然，各大种鸡公司都承认，进口的祖代鸡确实没有MG和MS感染，因为母源抗体是阴性。然而，在国内饲养一段期间后，就都出现了一定比例的抗体阳性反应。而且，血清抗体反应阳性率与其后代的健康呈正比例关系。在中国能不能以及如何饲养和繁育出没有MG和MS感染的鸡群，就成为各大养鸡公司最关心的问题。

2016年11月，山东益生种畜禽股份有限公司向法国哈伯德国际育种公司引进曾祖代白羽肉鸡（HBD），成为国内唯一一家饲养有曾祖代白羽肉鸡的繁育育种公司。支原体的防控关系着种源品质，能否保证HBD曾祖代保持在无支原体感染状态成为本公司工作的重中之重。通过一年的努力，该批曾祖代鸡已完成了一个完整的生产周期，经一年系统检测观察，证明确实仍保持在无MG和MS感染状态。本文介绍了本公司如何通过实施严格的生物安全隔离和多项控制措施实现无支原体感染的具体做法，供本行业其他公司借鉴参考。

1. 材料与方法

1.1 材料与试剂

2. PCR引物由上海英潍捷基（上海）贸易有限公司合成；核酸提取试剂盒、PCR反应试剂盒、琼脂糖、TAE均购自北京全式金生物技术有限公司。 MS疫苗株（批号为MSH 172452A）、MG疫苗株（批号为MGS 170911A）作为阳性对照，购自澳大利亚生物资源。鸡滑液囊支原体抗体ELISA检测试剂盒为荷兰BioChek公司产品，批号为：FS6308。

1.2 方法

2016年11月，山东益生种畜禽股份有限公司从法国哈伯德国际育种公司引进4000套哈伯德（HBD）曾祖代白羽肉鸡，饲养于新建的种禽场，该种禽场按照类似于SPF鸡舍的建设标准，采用先进的空气处理设备，将外界空气高效过滤后再进入鸡舍。同时对饲养员的要求非常严格，进入不同的鸡舍时，必须洗澡更衣。所有鸡只除按常规种鸡施用各种疫苗外，在5周龄使用TS-11株MG弱毒疫苗滴眼，同时免疫MG灭活疫苗，17周龄进行MG灭活疫苗二免。对MS既没有用灭活疫苗也没有用弱毒疫苗。采集不同周龄种鸡的咽喉拭子、产蛋孵化后的雏鸡和啄壳死亡毛蛋的气囊棉拭子，用PCR法做MG和MS的病原学监测；采集不同周龄种鸡的血清检测MS抗体。由于对MG使用了灭活疫苗，对MG只做雏鸡和啄壳死亡毛蛋的病原学检测，不做种鸡血清抗体检测。

1.3 HBD曾祖代鸡场禽支原体的生物安全防控措施的实施

1.3.1 全公司及曾祖代鸡场生物安全等级管理

虽然曾祖代鸡场是一个独立的新鸡场，但它也是在全公司范围内的一部分，自然会与其他鸡场甚至其他公司发生某种关系。为此，曾祖代鸡场的饲养管理的生物安全措施必须从全公司范围内实施。因公司厂区较多，为防止不同场间疫病的传播，场区实行动态的生物安全评定，制定等级管理制度，根据不同的病种，场区分为A、B、C、D四个等级，专人负责更新，物资设备、人员等的流动遵循由高到低原则，严格限制逆向流动，减少疫病在场区内部传播，最高级别场的各项生物安全措施严格落实到位。

A级：曾祖代场执行A级生物安全防控措施，确保MS、沙门氏菌、REV、ALV等重要垂直传播性疾病阴性；MG免疫后无野毒感染排毒；CAV免疫前无野毒感染；ND、AI、IB、MD、致病性腺病毒等传染性疾病无感染。

1.3.2 强化曾祖代场人员、物资入场管理制度

新员工所有物品由场区提供，饲养期间新员工入场隔离期延长至5天。

在原有生物安全措施的基础上，警卫室侧增加更衣间，更衣完毕，按标定路线进入浴室，进行3次洗澡消毒程序，之后更换生化防护服。浴室每周进行一次熏蒸消毒，人员离场后进行喷雾消毒。

进入场区人员携带的手机、电脑等电子产品时，先用酒精棉球擦拭外表，后置于紫外线消毒柜中照射消毒20分钟，最后进行熏蒸消毒。手机、电脑等只能带入场区办公室，非鸡舍用品严禁带入鸡舍，场区配备相机，供外来专家拍摄。

场区购买的蔬菜等物品需进行紫外和臭氧消毒30分钟以上。生产期内，禁止任何车辆入内。物资转运，生产用车等至场区外围开展作业时，在场区门口需全车消毒液清洗，冬季11-3月份使用卫可浩普消毒，其他月份使用卫可，稀释倍数为1：200，消毒时需要注意车轮部位消毒彻底。场区门口脚踏盆使用立洁消毒液，每2天更换一次，脚踏盆内的踏垫及时进行清洗更换。

育雏、育成场使用木花作为垫料，并在接鸡前一次进完，禁止使用稻壳。

1.3.3 场区内部管理

场区生产器具（转鸡笼、授精器械）专场专用，专舍专用，严禁从其他场、舍调用。

员工配备4套工作服，4双鞋，实行颜色管理，进入不同的区域更换不同的衣服鞋子。鸡舍工作间换鞋区划分合理，保证鸡舍内的鞋严禁外穿出舍。公用水鞋数量充足，员工定期刷洗。

加强宿舍卫生管理，每周安排住宿人员对本宿舍消毒，做好虫蝇防控。严格执行场区大环境消毒程序，隔天进行1次，疾病多发季节要做到每天1次。公共区域（如餐厅、浴室、洗刷间、走廊）安排内勤人员定期喷洒消毒液。鸡舍工作间，由鸡舍工作人员下班前整理，清洁，每2天喷雾消毒1次。消毒液需轮换交替使用，如实填写消毒记录表，包括消毒液名称、配制方法、消毒操作人员等。

场区配备大物品的消毒设施，用于孵化的蛋框、蛋盘等物品的消毒。所有消毒液配制、使用，人员、物资进出场等记录要完整如实填写，确保具有可追溯性。场区安装监控设备，监控各消毒措施是否认真执行。

1.3.4 强化潜在传播媒体生物的控制

曾祖代场每月灭鼠1次，场区要备有灭鼠药。

防鸟设施健全，卸料完及时清理撒的料，用水泥或挂网对所有容易藏鸟的地方进行封堵，冬季湿帘从外部进行密封。场区散落的鸟粪由后勤人员每天负责喷撒火碱消毒液浸泡，减少接触，防止二次污染。

甲壳虫的杀灭执行到位，安排专人按照月度进行巡查，转群前垫料及时清理，用密封袋分装转运。

控制鸡舍苍蝇，采用灭蝇措施：悬挂苍蝇板、鸡舍尾端粪池处加纱网。

控制鸡舍蚊子，鸡舍等工作间安装纱窗，使用灭蚊器，5-10月份非饮用水源定期添加杀虫酯。

1.3.5 饲料加工、运输控制管理

曾祖代场使用罐装料与料线，避免使用袋装料，防止中间污染过程。饲料车箱货车单独送料，做到专车专用，

1.3.6. 鸡群日常健康状况的监控程序

场区日常的生产数据做好各项记录。场区的病死鸡没特殊情况下直接发酵处理。异常时剖检或密封后送检研究院并附记录明细，便于调查分析疫病控制状况。

1.3.7  疫苗外源性病原检测程序

所有购买的活苗批次都要保存2瓶，用于追溯性调查，疫苗经外源性病原检测阴性后，方可使用。

活苗的外源性病毒和细菌检测包括：ALV、REV、CAV、MG、MS、沙门氏菌、大肠杆菌等，其中病毒的检测采用山东农业大学PCR与斑点杂交结合的方法，MG，MS采用Frey肉汤扩增和PCR结合的方法，细菌检测直接采用肉汤扩增，然后采用鉴别培养基培养的方法。

活苗需先检测才能使用，同时经检测的合格批次可适当多备货，以减少检测的频率，避免影响使用。检测出阳性的批次，送检第三方检测实验室进行复核。

1.4 对MS和MG感染的病原学检测

在这批曾祖代饲养过程的不同阶段，分别用PCR扩增MS和MG基因组以确定有无感染发生。由于没有使用MS疫苗而只用了MG的疫苗，对MG仅检测所产种蛋孵化出的雏鸡或毛蛋样品，而对MS还同时检测了种鸡不同时期咽喉棉拭子样品。

1.4.1  样品的采集与处理

咽喉拭子样品的采集：将棉棒插入喉头口及上颚裂处来回刮3~5次取咽喉分泌液，将样品端插入离心管剪下或折断，放入含有0.8~1.0ml PBS的1.5ml离心管中，备用。

气囊拭子样品的采集：将灭菌棉签插入雏鸡或毛蛋气囊内侧，来回刮3-5次，将样品端插入离心管剪下或折断，放入含有0.8~1.0ml PBS的1.5ml离心管中，备用。

曾祖代鸡群支原体病原监测周龄为4w、7w、9w、11w、13w、16w、21w、26w、30w、34w、40w、46w、52w、58w，每舍采集30对咽喉拭子。

种鸡群开产后，在30w、34w、37w、40w、43w、46w、49w、52w、55w检测30-40枚啄壳死亡毛蛋和1日龄雏鸡，采集气囊拭子，同时观察气囊是否浑浊，进行气囊评估。

气囊拭子DNA提取参照EasyPure Viral DNA/RNA Kit的使用说明，从咽喉拭子和气囊棉拭子挤出并离心的上清液提取DNA。

1.4.2  PCR引物

根据张秀美等[3]【4】已发表的针对MS序列的PCR检测引物，由上海英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。引物上游序列为：5’- GAA GCA AAA TAG TGA TAT CA-3’，下游序列为：5’-GTC GTC TCG AAG TTA ACA A-3’，扩增片段为207bp。参照赵杰等[4]筛选出的针对MG序列的套式PCR检测引物，灵敏性和特异性均较高。第一对引物上游序列为：MG-F1：5’-TTTTAT CCA GTA GTG GGT GC-3’，MG-R1：5’- TTA TCT AGG TCC ATT TTG TG -3’，扩增片段为738bp；第二对引物序列为MG-F2：5’-CGC AAT TTG GTC CTA ATC CCC AACA -3’，MG-R2：5’- TAA ACC CAC CTC CAG CTT TATTTC C -3’，扩增片段为300bp。

1.4.3 目的基因片段的扩增

MS-PCR反应体系为25µl：2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 µl，引物各1µl，ddH2O 7.5µl，提取的DNA模板 3 µl。PCR反应程序：94℃预变性5min，94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃延伸10min。

MG-PCR第一对引物反应体系为25µl：2×Easy Taq PCR SuperMix 12.5 µl，引物各1µl，ddH2O 7.5µl，提取的DNA模板 3 µl。PCR反应程序：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，  32个循环，72℃延伸10min。

第二对引物套式PCR反应体系同第一对引物，模板为第一次PCR扩增产物3µl。PCR反应程序：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。

反应结束，取7 µl PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，于紫外光线下观察并记录结果[admin6] 。

1.5 血清的支原体抗体ELISA方法检测

根据鸡滑液支原体抗体ELISA检测试剂盒[admin7] 的操作说明检测采集的血清。血清样本根据MS监测计划采集存栏量的1-2%。血清学抗体的检测频率增加，监测的周龄为1w、4w、7w、9w、11w、16w、19w、21w、26w、30w、34w、37w、40w、43w、46w、49w、52w、55w、58w[l8] ，按照95%的置信区间，预估5%的鸡存在感染，每次检测量为60只。

2 .结果

2.1 曾祖代种鸡咽喉拭子对MS的PCR检测结果

对HBD曾祖代鸡，从4周龄起至58周龄淘汰的整个饲养周期中，每2-6周从咽喉采集棉拭子对MS做PCR检测，总共采集14次共840份棉拭子样品，PCR检测结果均为阴性（见图1）。这表明，这批曾祖代种鸡在整个58周饲养期间，确实没有MS感染。

2.2  曾祖代鸡后代雏鸡MG和MS的PCR检测结果

在曾祖代种鸡30周龄至55周龄期间，对每2-3w收集种蛋孵化的1日龄雏鸡剖杀后在观察气囊变化后，用棉拭子取样做PCR检测MG和MS，总共9批共270份样品，均未检测到MG（图2）和MS（与图1和图2类似，省略）。这表明，这批曾祖代种鸡在整个58周饲养期间，确实没有检测到MG和MS对后代的垂直感染。

2.3 曾祖代后代啄壳死亡毛蛋MG和MS的PCR检测结果

在曾祖代种鸡30周龄至55周龄期间，对每2-3w收集种蛋孵化的啄壳死亡毛蛋气囊用棉拭子取样做PCR检测MG和MS，总共9批共313份样品，均未检测到MG（图3）和MS（与图1和图3类似，省略）。

啄壳死亡毛蛋这表明，这批曾祖代种鸡在至55周饲养期间，确实没有检测到MG和MS对后代的垂直感染。往往是发育完全的弱雏，相当于正常出壳的健康雏鸡，被感染的可能性更大些，但仍然都没有检测出MG或MS，这更能表明这批曾祖代种鸡在整个饲养期间，确实没有检测到MG和MS对后代的垂直感染。

2.4 HBD曾祖代种鸡对MS的血清抗体检测结果

从1w到58w龄种鸡淘汰前的整个生产周期中共采集了19批共1140份HBD曾祖代种鸡血清，经ELISA检测MS抗体均为阴性（见表1）。这表明，在58周龄的整个生产周期中从来没有出现过对MS的抗体反应，从血清学角度也证明了该群鸡没有始终保持在无MS感染状态。由于该群种鸡接种了MG疫苗，所以没有对MG抗体反应做检测。 

表1 HBD曾祖代不同周龄血清MS抗体阳性率

2.5 后代啄壳毛蛋气囊评估检测结果

HBD曾祖代后代各周龄采集啄壳毛蛋气囊无浑浊，评估均为优（结果见表2）。整个饲养期间，孵化啄壳死亡毛蛋占总孵化蛋数的0.27%，与正常情况下啄壳后死亡毛蛋占孵化蛋数的0.2%-0.3%相同。这二个指标都表明，该批曾祖代鸡后代中没有发现支原体感染的任何病理表现。

表2  HBD曾祖代后代啄壳毛蛋气囊评估检测结果

图1 曾祖代场52w采集咽喉拭子MS-PCR产物电泳图

M. DNA 2000 Marker；1.MS疫苗株；2-10. 曾祖代咽喉拭子采集样品。

图2 曾祖代场后代雏鸡采集气囊拭子MG-PCR产物电泳图

M. DNA2000 Marker；1. MG疫苗株；2-10.后代雏鸡气囊拭子采集样品。

图3  曾祖代场后代毛蛋采集气囊拭子MG-PCR产物电泳图

M.DNA 2000 Marker；1. MG疫苗株MG疫苗株；2-10.后代毛蛋气囊拭子采集样品。

3. 讨论

在规模化养殖的鸡群中，支原体感染是非常普遍的现象，而且支原体特别是对鸡致病性高的MG和MS在鸡群内很容易通过呼吸道造成横向传播。此外，MG和MS还能通过鸡胚从种鸡垂直传播给后代，在下一代造成显著放大的感染率[1]。在过去三十多年中，支原体感染在一直普遍存在于我国几乎所有鸡群中，养禽业似乎对于这种普遍存在的慢性传染病，除了建议用疫苗外，对它的控制似乎都感到无能为力。养鸡发达的欧美国家主要通过严格的生物安全措施已基本控制了鸡群的MG和MS感染，至少在许多种鸡群基本实现了无MG和MS感染[5,6,7,8,9]。但在我国，我们整个养禽业界总是认为中国的情况特殊，无法通过生物安全的措施来控制支原体感染。近年来，MG和MS感染的问题在我国蛋鸡和肉鸡中日趋严重，成为大型养鸡公司最关注的问题，对种鸡场相关的投诉不断发生。我们不得不重新考虑这个问题，难道中国的种鸡场只能靠疫苗而没有能力像欧美国家那样通过采取严格生物安全的措施来有效控制支原体感染吗？我们在对进口的HBD曾祖代鸡开始按最严格的生物安全饲养管理，特别是从一开始就认真细致考虑到有关生物安全、有关支原体传播途径的各个细节，对此采取了尽可能严格的措施。通过一个完整饲养周期的持续观察和检测，真正实现了无MG和MS感染，这批种鸡生产性能表现非常好，也没有任何相关的临床病理表现。特别是在连续多次的抗体和病原体检测中都完全是阴性，对其后代的数百个样品的PCR检测也都没有发现任何的垂直感染。能够控制支原体外源性感染，最重要的还是员工思想意识与培训认知、规章制度的贯彻执行力，同时场区人员、物资等与公司其他场区严格隔离、单独运行；空气的正压净化过滤；严格的生物媒介控制措施等生物安全措施的进一步强化起到了重要的支撑作用。这表明，在我国是完全可以通过生物安全来有效控制MG和MS的，这是我国大型种鸡场通过抗体和病原体检测证明确实实现无MG和MS感染的成功示范。当然，本公司将把在曾祖代鸡群这一成果示范的经验首先向祖代种鸡群推广扩大。[admin9] 

支原体MG和MS目前检测方法主要有分离培养法、电镜法、血清学方法以及分子生物学方法 [7] ，血清学方法由于常出现非特异性的交叉反应而影响诊断的准确性 [8]，而分离培养由于支原体对所需条件要求苛刻，培养时间长，操作繁杂，不适应现代集约化养禽业发展的需要。PCR 法方法简单快速，敏感性远高于前两种方法，可应用于该病的早期诊断和检疫，但技术条件要求较高，在检测时常由于抑制剂的干扰等因素而可能出现假阳性反应 [9] ，因此最终确诊需要多种检测方法联合使用[10]。本研究MS采用PCR与ELISA两种检测方法，以及结合临床剖检症状，确保了MS检测结果的准确可靠。MG采用套式PCR检测方法，与传统PCR方法相比，套式PCR方法具有灵敏、特异等优点，大大提高样品的检出率。

鉴于国内MG的感染压力和首次饲养曾祖代鸡群，没有控制经验，首批曾祖代采用了活苗加油苗免疫的模式，因此无法通过抗体转阳和采集咽喉拭子PCR检测来评估MG的野毒感染。现场主要通过种鸡群日常死淘鸡只气囊炎的观察，以及对种蛋孵化后啄壳死亡的毛蛋，进行气囊浑浊度来评估有无垂直感染发生。同时采集1日龄雏鸡和啄壳死亡毛蛋的气囊拭子进行MG的PCR检测，评估是否存在MG的野毒感染。如果啄壳毛蛋气囊浑浊以及气囊拭子MG的PCR检测为阳性，则证明曾种鸡群存在MG的野毒感染；如果啄壳毛蛋气囊正常以及气囊拭子MG的PCR检测为阴性，则证明曾祖代种鸡群为MG的阴性群。本实验结果显示曾祖代鸡群为MG阴性群。我们也对曾祖代产生的祖代进行MG的跟踪，在MG活疫苗免疫前，对鸡群的咽喉和日常死淘鸡气囊采样，PCR检测未检测到MG病原。 

参考文献

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