肉种鸡场鸡毒支原体感染的治疗效果评价

现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2020/9/27 12:12:42 关注：1304 评论： 我要投稿

  摘要：山东省某一大型父母代肉种鸡场饲养的肉鸡在约44周龄时证实发生鸡毒支原体（MG）感染。为评价有关敏感药物对MG感染的治疗效果，经对该场分离的MG毒株进行最低抑菌浓度（MIC）测定，选择敏感药物恩诺沙星和泰妙菌素实施对比性治疗，采用套式PCR检测治疗1个疗程后肉种鸡所产种蛋和种蛋孵化后期死胚中的MG感染情况，计算感染率。MIC测定结果显示：MIC≤5μg/mL的药物中，敏感性从高到低依次是沃尼妙林、强力霉素、泰妙菌素、恩诺沙星、大观霉素、泰乐菌素和氟苯尼考。对比性治疗结果显示：恩诺沙星和泰妙菌素两种药物不能完全清除MG对种蛋的感染，但可减少MG的种蛋传播，与未治疗的对照组相比感染率下降极其明显（P=0.006，＜0.01）；两种药物治疗1个疗程后的未上孵种蛋和种蛋孵化后期死胚的MG感染率差异不显著（P=0.391，＞0.05），表明两种药物治疗效果相近。结果表明：恩诺沙星和泰妙菌素两种药物对MG感染治疗有效，而且效果相近；通过套式PCR检测，计算种蛋或孵化后期死胚的MG感染率能直接、快速筛选出阻止或减少MG经蛋传播的敏感药物，评价不同抗菌药物的治疗效果。本研究为种鸡场MG感染和防控效果评价模式的建立提供了参考。
  鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticam，MG）感染主要引起鸡的呼吸道症状，又称鸡慢性呼吸道病（CRD），表现为气管、肺和气囊的呼吸道炎症。种母鸡感染后，病原可以通过血液从呼吸道传播到输卵管，导致产蛋量和孵化率降低，种蛋品质下降。MG可在鸡群中长期存在和蔓延，并可通过种蛋传播给下一代。该病流行于全世界鸡场中，给家禽业造成巨大经济损失。
  已普遍存在MG流行的国家，很难通过净化根除本病。目前国内控制MG感染的主要措施是药物防治和疫苗接种。抗菌药物已被证明可以控制支原体的经卵传播，减少临床症状和病变的出现。用于防治MG的药物主要有喹诺酮类、大环内酯类、四环素类和截短侧耳素类。临床治疗时，通过耐药性检测来选择敏感药物防治，可最大限度地提高药物的治疗效果和降低耐药性产生。
  目前关于抗菌药物对MG治疗效果评价方法的报道，主要是对MG引起的雏鸡呼吸道症状的治疗效果评价，而对种鸡感染MG引起的产蛋和孵化率下降的治疗效果评价却很少。PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高、快速等优点，适合MG的感染率调查。但由于鸡胚样品中MG含量极低，普通PCR往往检不出来，而套式PCR检测支原体具有更高的特异性。
  山东省某大型AA父母代肉种鸡场饲养的肉鸡，在大约44周龄时，出现产蛋率和孵化率降低以及雏鸡1周内出现较高比例的呼吸道症状，至46周龄时，该情况仍无明显改善，后经实验室检测确诊为MG感染，并分离鉴定出1株MG，命名为ZBMG01。该种鸡场的MG控制方案为产蛋期每隔1~1.5个月，用泰妙菌素饮水净化1次。
  本研究选择套式PCR检测种蛋或孵化后期死胚的MG感染率，来评定种鸡的药物治疗效果，以期为种鸡场MG感染和防控效果评价模式的建立提供参考。
  材料与方法
  最低抑菌浓度（MIC）测定
  支原体MIC测定方法参照文献。将MG分离株ZBMG01传至3~5代的对数生长期的培养物，用培养基稀释至104CFU/mL，作为检测用菌液。抗菌药物于96孔细胞培养板上，使用支原体培养基进行2倍连续稀释，使质量浓度为7.875×10-3~8.000×101μg/mL。于每个孔倍比稀释的抗菌药液中，加入同等剂量稀释至104CFU/mL的菌液。同时，设生长对照孔（不加抗菌药物的接种物）、终点对照（pH6.8的空白培养基）和无菌对照（pH7.8的无菌培养基）。将平板在37℃ 5% CO2的湿润二氧化碳培养箱中培养，直至生长组和终点对照具有相同的颜色。将引起无颜色变化的最小药物浓度定义为MIC。
  药物对比治疗
  该种鸡场发病后6周内，病情无缓和。根据MIC测定结果，选用10%恩诺沙星和45%泰妙菌素进行对比治疗。将同一饮水系统下的鸡群作为1个单位，分为3组：恩诺沙星治疗组，10mg/kg（体质量）饮水，连用5d；泰妙菌素治疗组，25mg/kg（体质量）饮水，连用5d；对照组，未用药物治疗。各组取5d后的未上孵种蛋以及上孵后孵化后期死胚各30枚送实验室检测。药物对比治疗后，调查种蛋孵化率。
  套式PCR检测
  基因组DNA提取
  鸡胚中细菌基因组DNA提取。使用试剂盒提取。无菌采集送检鸡胚和10枚7~9日龄SPF胚的2~4g卵黄囊（附带少量卵黄），加入到3mL PBS中，于4℃浸泡12~24h；摇匀后，取1.5mL浸泡液匀浆，12000r/min离心10min，弃上清液；将沉淀采用DNA提取试剂盒提取DNA。
  MG菌株DNA提取。MG分离株ZBMG01和标准株S6的模板DNA，采用水煮法提取，具体提取方法参考文献。
  引物设计与合成
  参考文献，利用DNAstar软件，对GenBank中的MG mgc2基因序列进行同源性分析，然后根据MG S6株（登录号CP006916.2）基因保守区域，合成2对引物（表1）。