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基于全面质量管理提升实验室非洲猪瘟病毒检测能力
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2021/3/28 19:55:40 关注：439 评论： 我要投稿
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摘要：非洲猪瘟已经成为我国养猪业防控的头号疫病，而荧光PCR方法是广泛用于各实验室非洲猪瘟病毒检测的首选方法。为提高相关实验室非洲猪瘟病毒荧光PCR检测的准确性，针对非洲猪瘟病毒荧光PCR检测过程可能存在的“假阳性”和“假阴性”现象，从全面质量管理理论的“人、机、料、法、环”等具体方面，详细阐述了这些现象产生的原因及改进措施或解决方案，从而为我国各级兽医实验室、屠宰场、养殖场、第三方检测机构等开展非洲猪瘟病毒检测提供参考，同时也为其他疫病病原的荧光PCR检测提供借鉴。
非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一种家猪和野猪烈性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为须通报动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。ASF病程短，发病率和死亡率高，病死率可达100%，给养猪业带来严重威胁。ASFV在外界环境中存活能力较强，传播途径多样，既可通过猪与猪、猪与蜱的直接接触传播，也可通过食物、粪便、运输工具、人员等间接传播。猪感染ASFV后很难产生有效的中和保护抗体，且目前尚无有效的疫苗可用，因此ASFV核酸检测是防控ASF的主要措施之一。我国自2018年首次暴发ASF以来，养猪业损失重大，各地纷纷加强了ASFV核酸检测。一些检测方法如荧光PCR、LAMP、试纸条等也开始用于ASFV检测。其中，针对ASFV核酸检测的荧光PCR方法，以其敏感、特异、快速、稳定的优点，在我国各级兽医检测实验室、养猪场、屠宰场、第三方检测机构等广泛应用。与此同时，随着ASFV检测强度增大和频率增多，很多检测实验室陆续出现荧光PCR检测结果“假阳性、假阴性”问题，严重干扰了正常的检测工作。这些问题或多或少与检测实验室的质量管理有关。本文根据全面质量管理理论和《ISO/IEC17025 校准和检测实验室管理体系》，结合部分ASF检测实验室的实际情况，总结了目前ASFV荧光PCR检测过程中遇到的问题，从全面质量管理理论的“人、机、料、法、环”等环节，进行了详细阐述和剖析，并逐项提出了相应的改进措施或解决方案，以期为相关从业部门开展ASFV检测提供参考。
人员
在影响ASFV检测结果的所有因素中，人是最关键的，是起到决定性作用的因素。ASFV检测的任何环节，不管是样品采集、运输、灭活、预处理、核酸提取，还是荧光PCR扩增体系配制、反应程序设置、结果判定和分析等，都离不开检测人员的参与。检测人员的基本素质和操作技能直接决定了检测质量。检测人员在任何环节出现失误，都有可能导致检测失败，因此对检测人员提出了较高的要求：一是在思想上要树立“规范操作、防止污染”的理念，深刻认识“操作不规范，核酸就会无处不在”的现象，从而在操作上严格要求自己；二是从制度上要加强采样和检测人员管理，设立ASFV核酸检测岗位，制定检测规程，提出检测技能操作要求，建立岗位和人员考核制度，定期对相关人员开展考核，考核合格者方可上岗；三是要对采样和检测人员定期开展ASF检测培训，强化其试验操作技能，提升其理论水平，规范其操作流程，使其熟悉法律法规，能够解决工作中经常遇到的问题；四是要在不同检测人员甚至实验室之间定期开展检测能力比对，通过不同人员和实验室的检测比对寻找差距，从而提高整体检测水平。
仪器设备
ASFV荧光PCR检测涉及的仪器有荧光PCR仪、组织匀浆机、离心机、移液器、生物安全柜等。在处理样品和加样过程中，这些仪器都存在一定的污染或交叉感染风险。这些仪器设备在使用过程中可能存在的主要问题有：
一是荧光PCR仪的精确性问题。荧光PCR仪是检测的最关键仪器，其精度高、仪器元件精细，但出现问题的类型复杂多样，既有硬件问题，也有软件问题。硬件问题有：荧光PCR仪滤镜污渍导致光路强度下降、灯源效能降低，加热槽个别孔污物过多导致受热不均或出现边缘效应等；软件问题有：吸光值不高、扩增曲线不典型、出现非特异性扩增、样品全部为阴性等。为确保 PCR 仪检测结果准确可靠，必须定期对荧光PCR进行校准；检测实验室可以根据发布的《聚合酶链反应分析仪校准规范》（JJF1527—2015），对实验室的实时荧光PCR仪温度和光学系统定期进行校准，或者采用商品化的PCR仪校准品试剂进行校准，以保障荧光PCR硬件正常运行。解决荧光PCR软件方面的问题主要注意以下几点：循环段与恒温段起始温度位置是否正确，各个阶段的温度与时间是否正确，荧光信号设置的采集点是否合适，所采集的荧光信号是否与说明书一致，实时荧光PCR反应结束后是否设置了无效基线范围。这些因素必须逐项检查，一一排除。
二是生物安全柜、离心机和核酸提取仪操作问题。这些设备如果操作不当，也会形成气溶胶，导致样品之间发生交叉污染。发生气溶胶污染以后，要尽快通风，增加通风频次和通风强度，开启紫外灯，照射时间延至2 h以上，同时用1%~2%的84消毒液进行消毒处理，让机体或腔体中的气溶胶成分充分降解，避免污染不断扩大。
三是移液器腔体的交叉污染问题。检测人员在使用移液器时，移液器的弹簧反复上下移动而吸取液体，一旦存在阳性样品，就容易在腔体内形成气溶胶，然后在吸取另外一份样品时造成交叉感染。因此，应定期开展移液器检测，一旦发现存在污染就要立即采取84消毒液擦洗等相应措施，并用样品再次进行验证。
检测物料
检测物料包括检测样品（含样品采集和处理）、耗材以及其他辅助用料。这些物料选择不当，也会引起检测结果的“假阴性”和“假阳性”问题。相应的解决方法为：
首先，样品的采集和处理要合理。样品采集尽管不属于实验室检测环节，但样品采集的好坏直接影响后续检测试验的进行。检测ASF可供采集的样品种类较多，既可以是抗凝血、血浆、血清、血块，也可以是淋巴结、肝脏、肾脏等组织脏器，甚至是口鼻分泌物、粪便样品以及环境样品等。不管采样时选择哪一种样品，总的原则是选择代表性样品，且不能在采样中引入影响荧光PCR扩增的物质。如：在采集猪的全血时，抗凝剂就不能用肝素，因为肝素会强烈抑制PCR反应，造成假阴性，所以可以选择EDTA钠盐；采集唾液样品时，要加入DNA酶抑制剂，且样品采集后应迅速冻存，以免唾液中的酶破坏和降解病毒核酸。
其次，选择的检测耗材要合适。检测中常用的吸头、离心管、荧光PCR管等耗材，材质不同，质量也参差不齐，有些劣质的吸头上含有PCR抑制剂，可能导致PCR出现假阴性，有的吸头表面粗糙，容易残留液体，移液过程可能导致加样量不准，影响荧光PCR反应。有条件的实验室可以选择带滤芯以及无DNA酶和RNA酶的一次性耗材，这样可以避免吸取液体时发生气溶胶的交叉污染以及耗材的不均一性对PCR检测结果的影响等。
最后，选择的辅助用料应不影响检测。如：荧光PCR 反应管/反应板的选择要考虑仪器的匹配性，不同型号荧光PCR仪使用的PCR管有所差异，有使用100 μL的，也有200 μL的，还有两种型号都使用的；另外，两种型号PCR反应管的反应盖帽也有差异，如果不能良好配套，就可能导致PCR管盖帽多余部分被105 ℃高温的PCR 仪热盖熔化。除此，荧光PCR仪器的光路有顶部采光、侧面采光和底部采光等多种方式，所以应选择与该仪器匹配的PCR管。
检测方法
ASFV荧光PCR检测方法包括ASFV核酸提取和荧光PCR扩增两个主要步骤。核酸提取方法很多，包括浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法、柱式法和磁珠法等，不同的提取方法对检测结果有显著影响。浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法无需特殊仪器，但操作繁琐，且提取核酸的质量不高，现在很少使用；柱式提取法和磁珠法的提取效率差别不大，但柱式提取适用于小型实验室或样品数量不多时使用，磁珠法更适用于自动化操作，还可避免柱式提取容易形成气溶胶污染的风险，但需要购买磁珠法对应的核酸提取仪器。不同的实验室可根据自身检测目的、样品种类、检测数量、人员素质、实验室硬件等综合考虑选择适合的提取方法。除核酸提取方法以外，荧光PCR扩增也非常重要。自2018年底中国动物疫病预防控制中心第一批ASFV快速检测试剂盒比对公布以来，国内已有数十家生产厂商取得比对认可，有的厂家已经获得农业农村部批准，这些厂家均可以提供ASFV荧光PCR检测试剂盒。因此，用户在选择检测试剂盒时绝不能贪图便宜选择一些“三无”产品，特别要避免使用伪劣、过期或失效试剂盒。另外，荧光PCR方法极其敏感，用户在使用荧光PCR检测试剂盒时要仔细对照试剂盒的说明书操作，每次使用时应将试剂盒置于冰上，用完后尽快将试剂盒冷冻保存，试剂盒的冻融次数也不宜过多。
检测环境
检测环境是指开展荧光PCR检测的环境，包括检测实验室的选址布局、分区设计、室内装修、通风等。如果实验室选址布局科学合理，出现污染的概率就会大大降低。PCR实验室的设计应当遵循“各区独立，注意风向，因地制宜，方便工作”的十六字方针。
“各区独立”是指要将实验室严格分隔成试剂配制区、核酸提取区、核酸扩增区等3个物理上完全独立的功能室，各功能室间不能直接相通。如果各区之间的传递采用传递窗，则传递窗应为密封严实的双开门且带有连锁装置，传递窗内要有紫外灯照射装置，每次打开使用传递窗后都要进行紫外灯消毒，且物品经传递窗传递的路线应该是单向的，要特别注意避免不同区之间的直接相通。各区内都应有缓冲间，避免直接进入试验区域。
“注意风向”是指注意各区的压力和气流的流向是不同的。试剂配制区主要用于配制试验用试剂，如裂解液、提取液、引物探针、PCR反应液等。这些试剂应保持无污染，远离阳性样品、阳性PCR产物、阳性对照等污染源，应严格管控其他区域的材料和设备（有可能携带污染成分）进入本区域，因此这一区域的压力应保持正压，保证气流的流向始终从试剂配制区流向其他区域。核酸提取区涉及样品的剪切、研磨、粉碎、匀浆、离心、提取等步骤，如果处理的样品为阳性样品，就会存在阳性样品形成气溶胶污染环境的风险，因此该区域应与其他区域严格隔离，区域内的一切物品不得带入其他区域。为防止阳性样品形成的气溶胶溢出，本区域的压力应设为负压。核酸扩增区是用来扩增核酸的区域，在此区域核酸会大量扩增，这一区域管控的关键是防止扩增产物的溢出和污染，因此该区域的压力应为负压，所有设备材料均专用，不得移出该区域。
“因地制宜，方便工作”是指在生产实际中，实验室的建设和设计应根据使用者的用途和费用不同而有所差异，只要实验室符合标准，就没有必要要求所有实验室都完全一样。各实验室在设计和布局时，应以最大限度地考虑日常检测工作更方便为目的。
结语
荧光PCR作为一种成熟的技术已经广泛应用于ASFV检测。由于荧光PCR技术的检测灵敏度极高，因此检测过程的很多因素都会严重影响检测结果，如样品中含有反应抑制物、荧光PCR仪存在故障、检测人员出现操作误差、实验室内存在交叉污染等，都很容易出现假阳性或假阴性结果。防止实验室出现“假阳性、假阴性”是一个长期艰巨而细致的工作。尽管本文从“人、物、料、法、环”等环节进行了分析，但每一个检测实验室的情况都不同，因此仅能提供一些基础的原则，相关检测实验室应根据自己实验室的特点，结合“人、物、料、法、环”等环节提供的措施，在此基础上建立和实施针对性更强的实验室质量管理体系，把检测实验室中的所有操作都以标准的管理文件表述出来，形成质量手册、质量体系程序文件及标准操作程序，规范各种操作和管理行为，更好地控制和预防各种污染。
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| 文章作者：张志等 中国动物检疫 文章编辑：一米优讯 |
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