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丁向东1，王楚端1，张 勤2
（1. 中国农业大学动物科学技术学院，畜禽育种国家工程实验室，农业农村部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193；2. 山东农业大学动物科技学院，山东泰安 271018）
摘 要：基因组选择已成为动植物育种的革命性技术，在我国猪育种工作中也逐渐开展，但我国猪基因组选择实施情况并不乐观。本文针对我国猪基因组选择育种实践中存在的问题和痛点，利用自主知识产权的液相芯片优势，提出了“先低后高，先多后少”的基因组育种新策略，通过具体案例，比较了新策略与传统的基因组选择策略和常规育种的优势，新策略成本降低，基因组育种效率提升，且更容易实施。本研究结果有助于基因组选择技术在我国猪育种领域的推广。
1 基因组选择的意义
随着分子生物学技术的突飞猛进，基因组选择技术在奶牛、猪、鸡、作物、林木和水产生物中开始大量研究和应用，是动物育种中继BLUP 方法后，又一具有里程碑式意义的育种新技术、新方法。理论和育种实践表明，基因组选择的准确性高于传统BLUP 方法，可加快遗传进展，提高育种效益。以基因组选择为核心的分子育种已带来了畜禽育种的巨大变革，成为推动畜禽育种前进的强大动力。基因组选择在猪上的优势主要体现在：①能够进行早期选种，准确性与基于性能测定的常规育种相当，远高于传统的系谱指数准确性，对公猪去势和仔猪断奶分群具有重要价值；②对常规育种效率低和难以度量的性状意义重大，如繁殖性状、饲料报酬、肉质、抗病力等。因此，基因组选择对我国猪育种具有重要的现实意义。目前，基因组选择也是我国种业振兴计划中大力发展的育种技术。
2 我国猪基因组选择实施痛点
我国自2017 年启动猪基因组选择计划以来，全国30多家优秀育种企业积极参与，构建参考群，并制定基因组育种计划。参考群体是基因组选择的前提，虽然很多企业已建立了参考群体，但基因组选择实施情况并不乐观，很多育种企业仍停留在参考群体构建阶段，一些企业即使实施了基因组选择，规模也不大，影响了基因组选择的效果。导致这一现象的原因有：①芯片价格高，影响了在早期选择群体的广泛应用。目前主流的基于Illumina 平台的50K芯片（纽勤50K或中芯一号）检测价格每头平均180~200元，如果大规模进行基因型检测，育种成本太高，因此企业迟迟不敢开展基因组选择育种应用；②由于基因型测定成本高，测定数量受到限制，发挥不了基因组选择早期选种的优势，虽然选种准确性有所增加，但是没有进行芯片检测的个体会有遗珠之憾；③芯片检测速度满足不了育种需要。大多数企业一般在仔猪出生后10~14 d阉割小公猪，因此要求能在14 d 前根据基因组育种值选出留下的个体，后期进行性能测定，较差的公猪进行阉割去势。而当前的芯片检测速度普遍偏慢，很难跟上企业的育种节奏，从技术上影响了基因组选择的应用。
因此，为加大基因组选择在我国猪育种中的应用，需要采用新的策略和技术。近年来，基于靶向捕获测序技术的液相芯片由于定制灵活、可任意增删SNP 位点，逐渐成为生物芯片的革命性技术。国内已相继开发了多种动植物液相芯片，中国农业大学开发了猪50K 液相芯片（专利：一种基于靶向捕获测序的猪50K 液相芯片及其应用；申请号：CN202110359470.7），根据育种场景需要，可分拆为1K、10K（专利：一种猪全基因组低密度SNP芯片及其制作方法和应用；专利号：ZL201711190317.6）和40K，用于品种鉴定、系谱校正、基因定位和基因组选择等。与我国自主研发的华大测序仪结合，7 d可以完成芯片检测。本文在已建立参考群体的基础上（可以是纽勤50K、中芯一号或液相50K进行基因型测定），针对企业现状和远景规划，充分利用液相芯片的检测速度、灵活性和价格优势，制定基于液相芯片的基因组选择实施方案，为基因组选择在我国猪育种中的普遍应用提供参考。
3 核心思想与技术路线
3.1 核心思想
充分利用液相芯片的灵活性，将猪50K液相芯片拆分为10K和40K 2款芯片，早期利用10K低密度芯片对小猪进行大量基因型检测，提高早期选择（公猪去势前）的准确性和选择强度。经过早期选择后，对进入性能测定的个体使用40K芯片进行测定，与之前的10K合并为50K，继续进行基因组选种，根据个体表型信息、基因组信息和系谱信息，评估出最优秀个体进入核心群。同时，具有性能测定成绩和50K 芯片基因型的个体可作为参考个体，对参考群体进行扩大和更新，实现不增加分子育种成本的前提下，提高全程基因组选择的准确性和育种效益。
3.2 技术路线
图1 展示了基于液相芯片的基因组选择的实施流程：
3.2.1 初选和小猪采样（3日龄）
刚出生的小猪进行初步筛选，淘汰弱仔、外貌不合格以及有遗传缺陷的个体，剩余全部小公猪和母猪（可根据实际情况减少检测头数），采集尾部或打耳号组织样。
3.2.2 SNP 芯片检测（3日龄）
对采集的所有小猪组织样送至公司，进行10K猪液相芯片检测，仔猪10日龄内完成芯片检测。以周为批次或按公司生产节奏批次，将同一批次小猪送样，获得芯片基因型数据后，第一时间将芯片数据上传至公司数据中心，通过基因型填充技术， 将10K填充至50K（10K 同时包含在纽勤50K和液相50K芯片标记中），同时可利用10K芯片进行系谱检验和校正，提高基因组遗传评估的准确性。
3.2.3 基因组育种值（GEBV）计算（12日龄）
利用已构建的参考群体，采用一步法GBLUP估计候选小猪GEBV。一步法GBLUP 能同时利用表型、系谱和基因组信息，基因组育种值估计更准确，并计算相应综合多个性状的基因组选择指数。
3.2.4 实施第1 次基因组选种（14日龄）
根据单性状或综合基因组选择指数，在仔猪出生后14 d内进行小猪的第1次选种。根据群体公母猪年更新数量选择优秀种猪进入性能测定（具体数量与留种率有关），其余转入育肥或者作为种猪销售，出售的种猪可提供基因组信息及基因组育种值。
3.2.5 性能测定和40K 芯片检测
与参考群体的性能测定性状要求相同。联系芯片公司，根据之前的DNA 样，对进入测定的小猪进行40K 液相芯片测定，与其之前的10K 芯片合并为50K。一方面扩大了高质量的参考群体，另一方面提高第2 次基因组选择的准确性。
3.2.6 实施第2 次基因组选择和终选
将性能测定结束后的所有猪只个体测定信息上传至公司数据中心，重新计算各性状基因组育种值和基因组综合指数。每个个体采2 份血样，分别送疫控实验室，检测蓝耳病、伪狂犬、PED、圆环病毒野毒抗体。
3.2.7 终选
根据单性状或综合基因组选择指数，按需选留后备种猪，转后备猪群。其中蓝耳病、伪狂犬、PED、圆环病毒阳性个体独立淘汰；体型外貌有明显损征个体独立淘汰。
3.2.8 选配
按系谱及基因组信息开展选配，记录种公猪精子活力、实施AI 配种，记录配种记录。
4 具体案例分析
性能测定是现代猪科学育种的基石，以1 000头基础母猪的种猪场为例，在常规育种方案下，按国家生猪遗传改良计划要求，核心场每窝最低需要开展一公两母的性能测定。以母猪每年平均分娩2.2窝计算，则该场年度性能测定头数应为6 600 头，其中公猪2 200头、母猪4 400头。目前非洲猪瘟疫情下很难完成这个要求。利用基因组选择可以降低性能测定数量，结合参考群体更新、留种率等需求（表1），如果采用4周批次化生产，根据场子的测定容量，每年可以表型测定2 600头，每个批次分娩窝数和表型测定量如表2所示。
4.1 每年/每批次更新公、母猪数
1 000头基础母猪按表1的群体参数（可根据育种方案调整），每年需更新500头母猪，按后备猪淘汰比例10%计，共需留后备556头。批次化生产每批次更新38头，需留后备42.73头。同样，每年需更新50头公猪，共需留后备约56头。每批次4头，为简单起见，公猪后备猪淘汰率也为10%，需留后备公猪4.3头。
4.2 第1次基因组选种
每头母猪年平均分娩2.2窝，全场每年分娩2 200窝。小猪出生后，经过遗传缺陷等筛选后，每窝平均10头，则每批次初选后有1 700头（170×10=1 700头） 合格仔猪， 公母各半。每头用10K 液相芯片检测（公猪全部检测，母猪视情况可适当减少，可以为40%~100% 比例），如果以母猪60%检测计，则全年需检测17 600 头（2 200×8=17 600头），对于批次化生产，则每批次1 360头（170×8=1 360 头）。第1次基因组遗传评估后， 留下2 600头（867 公1 733母，按1公2母比例，可调整）进行性能测定，并根据之前留存的DNA 对这2 600 头猪进行40K液相芯片检测。对于批次化生产，则每批次留下200头进行测定（65公135母，按1公2母比例）。此阶段留种率：2 600÷17 600=0.148，其中公猪留种率为：867÷11 000=0.079；母猪留种率：1 733÷6 600=0.263。
4.3 第2 次基因组选种
性能测定结束后，进行第2 次基因组遗传评估，需选择556头母猪和56头公猪共612头留做后备。批次化生产则每批留公猪4.44 头、母猪42.2头进入后备。此阶段留种率：612÷2 600=0.235，公猪留种率：56÷867=0.065，母猪留种率 556÷1 733=0.321。结合整个育种流程，全年留种率为：612÷17 600=0.035，公猪留种率：56÷11 000=0.005，母猪留种率：556÷6 600=0.084，都远低于常规育种公、母猪的留种率。
4.4 成本
主要是10K 和40K 液相芯片的检测费用，10K和40K液相芯片检测费用当前为每头猪50~60元和70~85元， 以10K和40K分别为50元和85元计， 则全年10K液相芯片检测费用合计：50×17 600=880 000元。40K液相芯片检测费用：2 600×85=221 000元，合计：1 101 000万元。根据育种方案不同，基因组育种成本也略有差异。
需要说明的是， 进行测定的个体进行了10K和40K 2款芯片检测，合并为50K 芯片，与参考群体相同。在进行基因组选择的同时，每年参考群体扩大2 600头，为基因组选择准确性不断提高奠定了基础。
4.5 与常规育种效果比较
4.5.1 减少了性能测定数量
新的基因组选择实施方案充分利用10K芯片的价格优势，加大了早期选择的选择强度（公母猪留种率分别为0.079和0.263，如果进一步减少后期性能测定数量，公母猪留种率会继续减小），降低了后期测定压力，按国家每窝一公两母的最低要求，每批次平均需测定510头，而基因组选择可以降低性能测定数量，本案例减少到200头，每窝平均1.18头，随着参考群体扩大，后期测定可以继续减少，大大降低了性能测定费用，尤其是饲料报酬、肉质等测定昂贵的性状。虽然测定数量减少，但提高了全群选择强度，公母猪留种率分别为0.005 和0.084，常规育种按2 600头测定量计算，公母猪留种率仅为0.065 和0.321（表3）。按国家要求的6 600 头最低测定量计算，公母猪留种率为0.026 和0.126。
4.5.2 遗传进展加快
衡量育种效果的主要指标是遗传进展，其公式为：遗传进展=（选择强度×选择准确性×遗传变异）/世代间隔。其中，遗传进展与选择强度、遗传变异、选择准确性成正比，与世代间隔成反比。虽然分子育种方案比常规育种成本有所增加，但是遗传进展加快，选择准确性提高。在世代间隔、遗传变异不变的情况下，如表3所示，基因组选择方案整体选择强度是常规育种的1.69倍（2.208÷1.308=1.69）。根据之前研究，基因组选择准确性是常规育种的1.5 倍。与常规育种相比，分子育种群体平均遗传进展是常规育种的2.53倍，公猪和母猪遗传进展是常规育种的2.22倍和2.47倍。根据育种方案，可以计算遗传进展带来的经济收益。
新策略与以50K芯片为主的基因组选择实施策略比，如果性能测定个体数量不变，则新策略主要是第一次基因组选择利用10K芯片加大了检测数量，如果原来每窝检测3头，则同样的费用可以利用10K液相芯片检测12头，包括了每窝所有经过初选的仔猪，原来策略每年检测6 600头猪，用固相芯片和液相50K 的检测成本分别是132万和89.1万元。而原来基因组选择策略的留种率和选择强度与常规育种没有区别，只是选择准确性得到了提高。而新策略由于基因型个体数量增加，不仅提高了选择强度，而且选择准确性进一步得到提升。因此，新策略可以做到不增加成本或降低成本的前提下，取得比原有基因组实施方案更好的效果。
4.5.3 种猪销售收入增加
由于断奶前增加了基因组选择测定，没进入测定的公母猪具有基因组信息和基因组成绩，每头作为种猪销售时可以增加200元，减去10K芯片每头50元检测费用，可以带来150元额外收入，按40%的猪可以作为种猪卖掉（公猪较多，不容易卖，去势育肥）， 每批次170×8×40%×150=81 600元， 新方案与常规育种相比，全年由于早期基因组选择种猪销售可增加收入约106万元，基本与全年基因组实施成本相当。由于基因组选择可显著加快群体遗传进展，提高了种猪的经济价值，因此按照本文所建议的基因组选择策略，可以在基本不增加育种成本的情况下，为育种企业带来更多的育种产出，增加育种效益。
5 建 议
本文根据我国猪基因组选择在育种实践中存在的瓶颈问题，充分利用自主知识产权的液相芯片优势，提出了“先低后高，先多后少”的基因组育种新策略，能够有力推动基因组选择技术在我国猪育种领域的落地。但同时有几个事项值得注意和讨论：
第一，性能测定数量。新策略通过加大早期基因组选择的数量，提高基因组选择效率，降低了后期性能测定的数量。所举案例中，1 000头基础母猪根据场子测定容量和非洲猪瘟对测定的影响，年测定量为2 600头，随着基因组选择的实施，参考群体不断扩大，测定量还会继续减少。这低于国家对核心场性能测定每年至少6 600头的最低要求。研究表明，生长性状基因组选择的早期选择准确性与常规育种相当，而繁殖性状由于常规育种结束测定时尚无记录，其准确性与系谱指数一样，远低于基因组选择准确性。基因组选择更有价值的饲料报酬、肉质性状等测定，常规测定显然更难满足每窝一公两母的要求。因此对于开展基因组选择的企业，建议综合考虑性能测定量要求，从基因组检测个体数量和性能测定量方面考察，不必按原来的标准一刀切。
同时也应看到，即使开展了大规模的基因组育种，并不是意味着不做测定了。如果不更新基因组选择群体，随着世代的增加，标记与基因间的连锁不平衡程度会衰减，导致基因组选择准确性下降。另外，有测定成绩的个体基因组选择准确性会继续提升，更有助于选留最优秀的个体。因此常规育种仍是基因组选择的基石，仍需坚持。
第二，前期基因型检测比例。利用10K 低密度芯片在早期进行大量基因型检测，是新策略的核心，也是对新策略基因组育种成本影响最大的地方。由于公猪的重要性以及生产中阉割要求，因此本文建议初选合格的公猪全部送检，PIC 公司对公猪也是全部基因组测定（私人交流），成本实际上并没有增加多少，以5 头计，10K 芯片成本仅比1 头固态芯片检测费略高。母猪可以设定比例40%~100%，太低则跟之前的策略没有区别了，本文设置了60% 的比例，每窝3 头，总体下来每年基因组选择成本是110万元。如果设为40%、80%和100%，则总成本分别为99.1万、121 万和132.1万元，变化幅度不是很大。这些需要根据各场情况自行调整。
此外，公母猪的留种率、性能测定公母数量等参数都可以根据各场情况调整，笔者团队专门开发了相应的小程序，可以调整不同参数，并计算相应的成本和公母选择强度，预测基因组遗传进展，方便育种场制订基因组选择实施方案。
第三，不同芯片的兼容性。SNP芯片是基因组选择实施的前提，在猪上，多个大学、科研机构和公司开发了多款SNP芯片，不同芯片的统一使用可以通过基因型填充加以解决。研究表明，猪液相50K芯片与主流使用的纽勤50K 和中芯一号芯片之间的基因型填充是可行的。相同参考群体规模下，液相50K 作为基因型填充参考群体最理想，纽勤50K和液相50K 2款芯片由于相同位点最多，互相填充的基因型准确性更高。液相芯片基于靶向捕获测序技术，由于其灵活性，可以随时更新标记，容易定制新的芯片版本，但是如果不同芯片版本间相同的SNP 数量过少，则基因型填充效果很差，会影响2款芯片的联合使用。因此，需要考虑不同芯片的兼容性。
“国以农为本，农以种为先”，“猪粮安天下”，这些都凸显了猪在国家粮食安全中的地位，也反映了种在养猪业发展中的重要性。2021年提出的种业振兴行动方案 更是把种源安全提升到关系国家安全的战略高度。当前我国生猪育种从国家层面有中央到地方各级政府的支持，从技术层面有日益完善的新技术、新方法作为支撑，育种实践也从以高校科研院所为主转为企业主动育种，这些都表明我国生猪育种进入了黄金时期。虽然2018 年爆发的非洲猪瘟给养猪业带来了灾难，但其也促进了我国生猪业的转型升级，首先增强了生物安全意识，加强了生物安全体系建设，为育种提供了健康环境；其次越来越多的企业意识到“手中有粮，心中不慌”，纷纷加大对育种的投入，温氏集团、牧原集团、新希望、大北农、正邦等头部企业纷纷成立育种事业部或育种公司，通过新技术、新手段提升育种水平，保障种的高水平供应。相信通过持续不断的投入，我国定能培育出世界级的种猪公司。
我国虽然已建立了常规育种体系，取得了显著成效，但与国外仍有差距，以基因组选择为核心的分子育种为赶超世界生猪育种发达国家提供了机遇。但目前，猪上成熟的商用SNP 芯片主要来自国外公司，成为我国分子育种的卡脖子技术。液相芯片技术实现了从试剂到测序到基因分型的国产化，且能够根据我国育种需要进行调整。本文提出的新策略充分利用液相芯片技术优势，通过两阶段实施，提升育种效益，尤其在非洲猪瘟常态化情况下，通过早期大规模、低成本基因型检测可以精准筛选优秀个体，减少后期性能测定压力，既保证了生物安全，又提升了育种水平，使分子育种成为我国生猪育种的助推器。
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