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非洲猪瘟病毒的形态结构特征
谢春芳1,2，于瑞嵩1,2，董世娟1,2，陈冰清1,2
(1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2.上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程实验室，上海 201106)
摘 要：非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)自发现以来，从非洲大陆传播到欧洲、亚洲，中间短暂消失但不久又卷土重来，一直顽固地存在着，这是否与ASFV独特的形态结构有关系，值得我们进一步探索研究。ASFV的结构蛋白有50多个，其核心大DNA基因组由核壳、内膜、衣壳和外包膜层层包裹，可以抵御外界环境的侵袭和伤害。了解ASFV的结构形态及组装机制，有助于深入解析ASFV的降解切入点，从而控制ASFV的复制，瓦解成熟的病毒粒子，让ASFV彻底从猪群、传播媒介中消失。
关键词：非洲猪瘟病毒；大DNA病毒；形态结构非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)是一种双链大DNA病毒，目前是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)唯一的成员。非洲猪瘟病毒粒子直径为250 nm～ 300 nm，基因组长度为170 kb～194 kb；细胞内ASFV粒子直径约200 nm，病毒基因组与核蛋白聚集成病毒核心，核心外包裹有蛋白核壳，核壳外包裹着脂质内膜，脂质内膜外是二十面体蛋白衣壳，最后通过出胞获得病毒外膜，成为一个成熟完整的ASFV粒子[1-5](图1)。
ASFV在环境中非常稳定，在4 ℃血液中可保存一年以上，在肉制品中可保存数周。ASFV可在蜱类和猪中高效复制，并在两者之间循环传播[6]。
ASFV通过脱壳侵入细胞，病毒脱壳需要酸性环境破坏病毒的外膜和蛋白衣壳。在细胞的内泡小体内，病毒的外膜和二十面体蛋白衣壳被破坏，暴露出病毒内膜，病毒内膜与细胞膜融合，病毒核质得以进入细胞质内，感染宿主细胞。ASFV感染细胞后，在细胞质内质网附近的“病毒工厂(Viral Factories，VFs)”中进行复制[7]。
在早期核内复制阶段，ASFV会导致细胞核膜破裂并募集细胞S期特异性翻译因子——真核翻译起始因子4E/4G(eukaryotic translation Initiation Factor 4E/4G，eIF4E/4G)和真核翻译起始因子4E-结合蛋白1(eukaryotic translation initiation factor 4E-Binding Protein 1，4E-BP1)到病毒工厂，以增强病毒复制能力，然后在细胞质内进行病毒DNA复制和包装[8-10]。
1 病毒核心
ASFV粒子基因组和核蛋白形成病毒核心部分，ASFV pA104R是组蛋白样蛋白，属于核蛋白，对染色体的扭曲、弯曲、折叠等拓扑修饰发挥重要的结构和调节功能，以增加核稳定性。在ASFV复制周期，pA104R与DNA的相互作用并结合非常重要。二苯乙烯衍生物(Stilbene Derivatives，SD)1和SD4能破坏pA104R与DNA的结合；pA104R的β链DNA结合区(DNA Binding Region，DBR)的碱基突变也会消除pA104R与DNA的结合，pA104R未与DNA结合的ASFV不会进行病毒基因组的复制[11-16]。
病猪组织细胞中存在无病毒核心的ASFV粒子，说明ASFV粒子先完成病毒内膜、衣壳的装配，然后形成病毒核心基因组与核蛋白完成装配[17-18]。
2 核壳
核壳位于含DNA的核仁和内膜之间，是一个类似基质的结构域，包裹着核心。ASFV核壳是一层30 nm厚的蛋白层，主要由多聚蛋白pp220和pp62的加工产物构成。pp220和pp62的加工都依赖于主要衣壳蛋白p72的表达，pp62的加工还需要pp220前体的表达，pp220和pp62能够相互作用形成核壳状结构，这几乎占病毒总质量的三分之一。多聚蛋白加工是一个成熟的过程，伴随着核心组装，多聚蛋白pp220和pp62被S273R基因编码的半胱氨酸蛋白酶催化，通过共有基序Gly-Gly-X有序水解成蛋白，pp220水解产生p150、p37、p34和p14，pp62的主要水解产物是p35和p15。p150、p37、p34、p14、p35和p15形成ASFV粒子的几个主要成分，构成病毒核壳[19-23]。
3 内膜
ASFV内膜从细胞内质网膜衍生而来，依赖病毒p54，细胞内质网膜是病毒内膜的前体，内膜凸面上逐渐形成二十面体衣壳，内膜凹面上同时形成核壳[7]。
pE248R是ASFV内膜上的跨膜肽，在病毒外膜和蛋白衣壳破坏后，pE248R与细胞膜融合，病毒核质得以进入细胞质内，感染宿主细胞[2]。
在几种病毒感染中，脂质是形成VFs的基础，病毒利用膜接触位点(Membrane Contact Sites，MCSs)确保脂质转移到VFs，MCSs具有提供能量转移其他脂类的功能，如磷脂酰肌醇-4-磷酸(Phosphatidylinostol-4-Phosphate，PI4P)。PI4P在哺乳动物内质网(Endoplasmic Reticulum，ER)-高尔基体MCSs中由磷脂酰肌醇-4-磷酸-激酶Ⅳβ与一些同功酶如磷脂酰肌醇-4-激酶β(Phosphatidylinostol-4-Kinasesβ，PI4Kβ)或磷脂酰肌醇-4-激酶Ⅱβ(Phosphatidylinostol-4-KinasesⅡβ，PI4KⅡβ)局部产生。PI4P负责脂质结合/转移蛋白氧化淄醇蛋白(Oxysterol Binding Protein，OSBP)与高尔基体对接。MCSs中的驻留分子允许细胞器之间的非囊泡脂质和离子交换，OSBP将胆固醇从内质网转运到高尔基体，在高尔基体中聚集，然后再转运PI4P。内质网中PI4P的水解为这一过程提供能量。一些研究表明，MCSs机制和PI4P依赖的固醇穿梭蛋白参与了病毒复制。病毒会招募一个宿主PI4P激酶在其复制细胞器中富集PI4P。在所有的情况下，PI4P脂质都会促使OSBP进入VFs，导致ER和VFs之间形成MCSs，在该MCSs中，胆固醇/PI4P交换驱动胆固醇在复制位点的积聚[24-26]。
ASFV pE199L是一种富含半胱氨酸的结构多肽，定位于病毒的内膜，具有细胞溶质分子内二硫键。pE248R是ASFV内膜上的另一个跨膜肽，pE248R和pE199LR与细胞膜融合，病毒核质得以进入细胞质内，形成ASFV进入细胞的一种融合机制，感染宿主细胞[7,27]。
p17是由三个连续α螺旋组成的蛇形结构，p17与外衣壳蛋白p72结合，紧密连接ASFV病毒内膜与外衣壳，稳定病毒的外衣壳结构与形成[28]。
4 衣壳
ASFV粒子呈二十面体结构，由50多种衣壳蛋白组装完成，二十面体结构在被感染的巨噬细胞细胞质内接近核附近微管组织中心(microtubule organization center)的VFs区域内组装形成。p72是主要的结构蛋白，属病毒晚期表达的蛋白，完成一个病毒粒子的衣壳装配需要8 280多个p72，此外还需p17、M1249L、p49和H240R，其均为辅助蛋白[3,28]。
p72以同源三聚体连接，每个单体呈双胶卷形态，使p72三聚体看起来像一个六聚体，称为“伪六聚体”(pseudo-heameric capsomers)，每一个卷含有8个反向平行的β链结构，并有4个暴露在外的环D1E1、D2E2、F1G1和H1I1暴露域(Exposed Regions，ERs)。这些ERs与N-端结构域(N-terminal Domain，NTD)决定了病毒不同型之间的特异性差异，这与许多病毒衣壳蛋白相似。辅助蛋白p17是一种非常重要且非常丰富的蛋白，是内膜蛋白也是衣壳蛋白，是病毒衣壳组装和二十面体形成必需的蛋白。p17的胞外域与p72的残基结构域紧密结合，将p72帽状体牢固地锚定在内膜上。5个penton蛋白组成一个五聚体，骨架蛋白M1249L黏附到五聚体核心，将帽状体连接在一起，不仅形成了一个五边体，而且连接了两个相邻的五边体形成骨架，使五聚体核心与p17可以在内膜上移动，并与其他衣壳蛋白形成广泛的分子间网络，从而推动衣壳框架的形成。M1249L长 100 nm，作为衣壳对称三边体的边连接2个对称的五边体，衣壳蛋白p49(B438L)是形成衣壳顶点所必需的。p49是一种完整的膜蛋白，它不参与病毒粒子从病毒组装点到质膜的运输。p72三聚体、penton五聚体在p17、p49与M1249L的作用下形成衣壳的对称三边体和五边体，20个对称三边体和12个对称五边体构成了病毒的外衣壳[3，28-33]。
H240R有240个残基，富含β链，不同于p72，但与p72同源，具体结构还不清楚；在外衣壳的内膜面，还有许许多多未知的小衣壳蛋白[3，28，33]。
衣壳组装依赖于衣壳蛋白p72和p49(B438L)的表达以及病毒伴侣蛋白B602L的表达。静电力在病毒衣壳的组装过程中起着重要的作用，引导着衣壳小体在合适的距离和方向上相互作用，维持稳定的组装。组装外衣壳蛋白的ASFV粒子直径约200 nm[34]。
5 外包膜
ASFV粒子在细胞质的VFs中没有外包膜，只形成四层结构，即病毒核心、核壳、内膜和衣壳。VFs中形成的ASFV粒子在出芽时通过细胞质膜获得病毒外膜，从而成为一个成熟的病毒，其直径为250 nm～300 nm。当ASFV粒子移动到酸性环境时，病毒通过质膜发芽获得的外膜就消失了[2，3，35-36]。
6 小结
非洲猪瘟从发现至今已有近100年的历史，给养猪业及人类社会的公共环境带来了非常严重的危害，对ASFV的研究越深入，根除ASF的目标就越近，通过各种电镜和分析技术，我们正在逐渐剥开ASFV包裹着的一层又一层膜和蛋白，相信无ASFV的这一天一定会到来。
参考文献：略
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