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猪圆环病毒2型检测技术研究进展
陈旭，汤德元*，杨志刚，晏仁潭，韩超逸，罗柳，陈阊峥，袁盛林，廖正波
（贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025）
猪圆环病毒（PCV）是迄今为止发现的一种最小的动物病毒。猪圆环病毒依据其致病性和基因组差异分为无致病性的猪圆环病毒1型（PCV1）和有致病性的猪圆环病毒2型（PCV2），猪圆环病毒3型（PCV3），猪圆环病毒4型（PCV4）。PCV2主要侵害机体的免疫系统，引起机体继发感染断乳仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎和肾病综合征（PDNS）、猪呼吸道病综合征（PRDC）、母猪繁殖障碍、肉芽肿性肠炎、仔猪先天性震颤等疾病。PCV2现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的引起猪免疫障碍的重要传染病病原，因此建立即时有效的检测PCV2的技术方法尤为重要，文章综述了多种PCV2检测技术，旨在为养殖场PCV2有关疾病的检测防控提供技术支持。
病毒分离培养
PCV2可选用猪肾细胞、PK-15细胞、猪睾丸细胞等来进行分离培养，取病死猪的淋巴结组织研磨，加PBS缓冲液制成悬液，-20℃反复冻融3次后离心取上清液，经过滤器过滤除菌，接种易感细胞，置于37℃培养箱，盲传1~3代后进行PCV2抗原或核酸检测加以鉴定。
病毒分离培养可以观察到病毒接种细胞后产生的细胞病变，但此方法首先需要培养出状态较好的病毒易感细胞，这个过程比较耗时，操作过程中容易遭到污染，且血清成本高，因此不适用于常规检测。
电镜观察
电子显微镜是用电子束代替可见光的显微装置，一种高放大，高分辨的大型精密仪器。电镜检测技术主要有扫描电镜和透射电镜，扫描电镜主要通过发射电子聚焦光束来扫描PCV2样品的表面形态确定病毒，透射电镜则是通过电子束穿透组织和细胞来观察PCV2感染细胞内的超微结构来检测病毒。电镜法具有直观，快捷等优点，但是电子显微镜设备价格较高，且该法只能观察病毒的外观形态，很难与同科的病毒相区别。
聚合酶链式反应
聚合酶链式反应（PCR）是利用DNA半保留复制原理，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计特异性引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP，从而完成特定基因的体外复制。这是一种快速，灵敏，特异性强，对样本纯度要求较低的病原学检测方法。在普通PCR的基础上，发展出了多种形式的PCR技术，包括实时荧光定量PCR、多重PCR、数字微滴PCR、其他PCR等。
环介导等温扩增法
环介导等温扩增法（LAMP）是2000年时开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在恒温条件保温30~60min，即可完成核酸扩增反应。此法的灵敏度高，特异性强，且不需要电泳，可以进行室外检测，但反应需要的仪器价格昂贵，检测成本较高。
重组酶聚合酶扩增
重组酶聚合酶扩增（RPA）技术使用重组酶与引物结合形成的复合物能在模板上寻找同源序列，定位后就会引发链交换反应并启动DNA合成对模板上的目标区域进行指数式扩增。实时RPA测定为快速，简单和可靠地检测PCV2提供了一种替代工具，特别是在没有专业设备仪器的偏远农村地区。
重组酶辅助扩增
重组酶辅助扩增（RAA）是一种等温核酸扩增技术，可以在恒温下快速扩增靶基因片段，使用带有相应抗体的试纸可以目视检测标记有特定分子的扩增产物。具有特异性强、灵敏度高、重复性好、操作方法简单等优点，所以PCV2RAA试纸适用于PCV2现场的快速临床检测。
原位杂交法
原位杂交法（ISH）是指用特定标记的已知序列核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸序列进行精确定量定位的过程。HansenMS等用原位杂交法（ISH）检测PCV2的核酸，在受PMWS影响的猪中，20头猪胸腺样本中有19份检测结果为阳性，阳性率为95%。BaróJ等在96头患有肠道疾病并提交尸检的猪中，72头猪通过原位杂交（ISH）显示PCV2呈阳性，阳性率为75%。
其他分子生物学方法
光学表面等离子体共振（SPR）免疫测定法是一种非破坏性、无标记、实时的检测方法。SPR是一种物理光学现象，SPR信号随金属表面折射率的变化而变化，通过SPR角的生物反应过程的动态变化可以获得生物分子相互作用的特定信号。HuJ等基于表面等离子体共振（SPR）并建立了特殊的分子鉴定膜，研究了一种灵敏且无标记的分析方法，用于检测血清样品中PCV2。SPR生物传感方法的理论检测限计算为0.04μg/mL。相应地，回收率从81.0%到89.3%不等，与PCV2检测试剂盒相比，该表面等离子体共振生物传感系统通过线性度、精度和恢复率进行了验证，证明了表面等离子体共振免疫测定是可靠和稳健的。
免疫学检测
酶联免疫吸附测定
酶联免疫吸附测定（ELISA）方法是利用抗原抗体之间专一性结合的特性，通过特异性显色反应对抗原或抗体进行检测。该方法具有特异性高、操作简便、耗时少、结果便于观察等优点，目前被广泛研究和应用。常见的ELISA检测方法有：间接ELISA，双抗夹心ELISA，竞争性ELISA。
免疫层析试纸条
免疫层析是出现于20世纪80年代初期的一种新型的，快速的免疫分析方式。将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入待测样品后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动到固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原与该抗体发生特异性结合，用免疫胶体金染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。该试纸可用作现场快速诊断PCV2抗体的候选方法。
其他免疫学方法
单结构域抗体（sdAbs）和碱性磷酸酶（AP）的融合已被证明可用作免疫诊断试剂，psdAb-AP融合效率高，需要更少的操作步骤，并且能在短时间内结束测定。YangS等描述了一种与碱性磷酸酶（AP）融合的单结构域抗体（sdAbs）用于检测PCV2，为了评估psdAb-AP融合作为诊断试剂的实用性，将融合用于蛋白质印迹（WB）、直接ELISA和免疫细胞化学测定（ICC）。结果表明，sdAbs与AP的融合为开发更优质的免疫试剂提供了有价值的途径，为PCV2检测提供了一种简单，方便和灵敏的方法。
小结
PCV2引起的猪圆环病毒病的发生对生猪生产有着重大影响，预防和控制该类疾病对于最大限度地减少经济损失至关重要。PCV2的检测技术数不胜数，其中病毒分离鉴定方法因其耗时长，血清成本高等缺点不适于常规检测。电镜观察也因为电子显微镜设备价格较高，难以与同种属病毒区别等劣势同样不适于常规检测。目前，PCV2在分子生物学方面的抗原检测方法研究较多，如PCR，LMAP，RPA，RAA，ISH等；而免疫学检测方法研究较少，如ELISA，免疫层析等。许多研究人员对常用的抗原抗体检测方法以外的新型检测方法做了一些探索，发表了一些具备良好应用前景的PCV2检测鉴定方法，但仍需继续发现更先进、更高效的临床检测技术，为临床兽医科技工作者建立快速、简便、准确、实用的PCV2检测方法提供参考。
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