猪冷冻精液研究应用进展及问题分析与展望

现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2023/8/3 8:33:29 关注：493 评论： 我要投稿

  猪冷冻精液研究应用进展及问题分析与展望
  张志彬，于永生，钱芙蓉，李兆华 *
  （吉林省农业科学院，吉林 长春 130000）

  1  了解猪冷冻精液
  1.1 猪冷冻精液应用的优点
  猪精液冷冻保存的最大优势是可以延长猪精液的使用期限。常温下新鲜精液使用时间有限，只能在1 d内使用。在17℃下用常温稀释液处理的精液，猪精子的存活时间可达2周以上。利用液氮等为冷源，保存用冷冻稀释液处理的精液，只要精液处于液氮内，理论上可以无限期保存。
  从经济效益方面考虑，猪精液冷冻保存可以降低引种及饲养管理成本。以2022年末为例，全年能繁母猪4 400万头，按年产2.2窝，受胎率80%计算，如果采用本交（公母比例1:30），大约需要150万头的公猪，如果全部使用冷冻精液，按每头公猪年提供4 000头份计算，只需要约3万头公猪，与本交相比，可减少98%的公猪饲养量，极大降低了公猪养殖成本，增加了经济效益。
  使用猪冷冻精液精的另外一个优点是提高了优秀种公猪的利用率。采用本交的配种方式，优秀种公猪的利用率极低，满负荷配种每年可配母猪数仅为100余头，而使用冷冻精液每头优秀种公猪每年可配4 000头以上的母猪。高性能的种公猪与更多数量的母猪配种，可迅速提高优质基因的覆盖面，再加上冷冻精液便于储存、便于运输、便于使用，不受地域、时间的限制，便于跨区域、跨国引入优秀的种质资源，辐射区域可全球化，打破了鲜精使用区域辐射小的限制，促进品种改良，提高生产性能。
  另外，公猪冷冻精液可以在后裔测定或疾病检测后再开始大量供应，为稳定的遗传进展和严格的生物安全提供保障。从健康角度考虑，冻精为疾病检测提供了足够的时间，冻精还能为大型的人工授精站暴发疾病时提供稳定的精液供应保障，并可实现无病供种。并且猪冷冻精液对我国优质地方猪资源的保护和利用、体外胚胎生产体系、现代生物工程技术具有重要意义，可提供丰富的试验材料用于研究和生产。
  1.2 国外猪冷冻精液的研究历史
  冷冻保存哺乳动物精子的最早期尝试可以追溯到18世纪和19世纪，Spallanzani在1776年首次观察到自然界中的冰雪对人精子存活的影响，110年后的1886年，Montegazza发现经过-15℃的低温冷冻的人精子仍有部分可以存活，进而提出了“用低温冷冻储存动物的精子建立精子库，以保存优良品种的家畜”的设想，但由于条件所限，精子库未能建立，但打开了精液冷冻保存的新篇章。
  1949年，随着研究发现甘油具有冷冻保护作用，甘油随即被应用于精子的低温保存，次年研究者用含10%～20%甘油的柠檬酸钠混合液保存-79℃牛精子，解冻后精子细胞活率为50%～90%，1951年开展了冻存的良种牛精子人工授精的试验，获得了生长发育正常的犊牛。在20世纪50年代，公猪、马和公牛的精子均被成功冷冻保存，1957年，利用冷冻精液生产的仔猪诞生。
  在20世纪70年代，研究者开展了猪冷冻精液精输精方法和剂型的研究，取得了巨大的进步。1977—1979年，美国、瑞士、法国、匈亚利、西班牙利用冻精配种母猪近千头，英国、澳大利亚也开展了用冻精配种母猪的小群尝试。
  英国Ploge家族公司花了近60年的时间研究猪冷冻精液技术，但平均活力仅在50%左右。2002年瑞典生产的5 mL细管冷冻猪精液开始出口，冻后精子质膜完整率平均为60%，精子活力为49%～53%，产仔率为73%，平均窝产仔数为10.7头，但仍未达到目前低温保存和新鲜精液输精的生产水平。目前猪冷冻精液精在国外商业化猪场的应用率仍极显著低于本交和液态精液的应用率。
  1.3 国内猪冷冻精液的研究历史
  我国从20世纪50年代初期开始对猪精液冷冻技术进行探索，在70年代逐渐建立技术体系。1975年西安市草滩农场试配了8头母猪，有4头产仔，平均每窝8.9头。1977年成立了全国猪冷冻精液精协作组。1975—1978全国利用猪冷冻精液精进行人工授精，累计配种母猪6 079头，情期受胎率为42.1%～61.3%。1980年全国第四次猪冷冻精液技术座谈会宣布我国猪的冷冻精液技术的研究仅用了四年多时间基本上获得成功，平均情期受胎率为58%。
  20世纪80年代，各高校、科研院所持续对猪冷冻精液进行研究，取得重大进步，1986年冷冻精液累计配种母猪6万余头，第一情期受胎率达70%以上，但产仔数显著低于本交。因此在随后的近20年，猪精液冻存研究和应用进展缓慢。
  进入新世纪以来，随着技术的发展和社会资本的进入，猪精液冻存发展迅速，并逐渐进入产业化。2015年左右，国内有单位生产的冻精解冻后精子活力最高达到80%以上，38℃条件下可存活5～6 h，通过对冷配母猪进行统计，发情正常健康的母猪情期受胎率胎率达已经达到常温液态精液的繁育水平。
  2015年以来，虽然有很多猪冷冻精液生产和销售的公司积极进行推广，但由于种种原因，目前国内猪冷冻精液的应用比率仍然很低。如何使好的技术更充分的利用成为生猪繁殖领域亟需解决的问题。
  2  认知猪冷冻精液
  2.1 猪冷冻精液的本质特点
  目前，关于精子细胞在冷冻、解冻过程中所发生的理化变化以及造成细胞损伤和死亡的原因研究得仍不够透彻。在精液冷冻解冻过程中，较为明显的变化包括细胞外溶质浓度增高、细胞脱水、细胞内结冰、蛋白质变性、细胞膜结构损伤等，存在多种关于冷冻保存机理方面的假说，如“两因素假说”、“电解质失衡假说”、“物理屏障假说”、“结构水假说”、“最小临界细胞容积假说”、“生物膜伤害假说”等。这些假说均能部分解释一些现象，但又都具有一定的局限性。
  猪精液冷冻保存的操作与其他畜种一样，都是将处理后的精液在超低温条件下保存，精子的代谢活动完全受到抑制，精子在生命相对处于静止状态，在任何时间均可解冻，理想的条件下大部分精子复苏生命活动并保持受精能力。因此，冷冻精液（包括猪冷冻精液在内）的本质特点就是精子保存时间长。
  关于猪冷冻精液研究及应用的种种优点都是依附于冷冻精液保存时间长这一本质特点并结合其他因素而衍生的。
  2.2 影响猪冷冻精液质量的因素
  猪冷冻精液的制作应按照生产操作技术规程，冷冻精液的质量质量受多种因素影响。
  2.2.1 操作规程与操作人员
  在众多因素中，操作人员是影响猪冷冻精液质量的重要因素。目前，出于技术推广应用的考虑，猪冷冻精液的生产和利用技术大体操作程序完全公开，均包含精液的采集及品质鉴定、平衡、离心去精浆、稀释后再平衡（4℃）、再稀释并灌装、冷冻、保存、解冻、稀释后人工授精等步骤。每一个操作步骤都会影响猪冷冻精液的质量。另外，母猪发情鉴定、人工授精技术的操作水平都会对冷冻精液的使用效果具有很大的影响。目前全自动化精液冷冻操还不能完全实现，完善的精液冷冻生产体系应该按照标准化的操作流程来进行，其中很多操作仍需具体技术人员来进行完成，因此必须加强操作人员的技术培训，使操作人员掌握规范的操作技能，以认真、严谨的工作态度来进行生产。
  2.2.2 原精的品质
  原精品质是直接影响冻精制作成功与否的决定性因素，原精的活力低于0.6，不论冷冻精液生产操作技术水平多么高超，都不会生产出活力超过0.7的冷冻精液。因此，必须重视原精的品质指标检测，尤其是要注意观察精液颜色、气味、胶状物等是否正常。对每次采精进行记录登记，对原精品质持续偏低的个体应停止采精，进行相应的治疗或淘汰。
  需要特别注意的是，与其他畜种的精子相比，猪精子耐冻性的个体差异性更为显著，可明显分为耐冻性好的精液（Good freezability ejaculate，GFE）和耐冻性差的精液（Poor freezability ejaculate，PFE），甚至同一精液中的不同射精段之间都存在显著抗冻的差异。研究发现，PFE组的精子冷冻后质膜完整性较差，且精子质膜中脂质含量下降，不同的脂质代谢水平和质膜中的长链多不饱和脂肪酸（PUFA）可能是导致公猪精子对冷冻保存抵抗力差异的关键因素。因此，在规模化生产冻精前，一定要对所用公猪的精液进行冷冻试验，也就是耐冻性筛选。解冻后精子活力、顶体完整性和畸形率等指标达到标准的公猪原精液才能用于冷冻精液的生产。并不是原精的品质好就一定能生产出质量优良的冷冻精液。
  2.2.3 冷冻稀释液配方
  冷冻稀释液是猪精子在冷冻和解冻过程中的营养剂和保护剂，决定了猪冷冻精液的质量。近十年来，我国在冷冻稀释液配方方面研发的巨大进展促进了猪冷冻精液技术水平的长足进步，现阶段解冻后活力达到0.7以上的稀释液配方都是非公开的，具有自主知识产权。
  冷冻稀释液配方的组成成分按照其功能可以分成营养剂、低温保护剂、冷冻保护剂及其他保护剂。一些成分是仅具有单一功能，但大部分成分具有多种功能。
  营养剂是为了补充精子的能量消耗，向精液中添加的能量物质，例如葡萄糖、果糖等用于提供冷冻精液生产过程中精子新陈代谢活动的能量需求。同时糖类也具有非渗透性冷冻保护剂和维持溶液渗透压的功能。低温保护剂主要指的是卵黄，现在常用的主要是鸡卵黄。虽然一直将卵黄当作冷冻精液最好的保护剂使用，但仍不清楚卵黄对精子起保护作用的机制。抗冷冻保护剂能保护精子在冷冻解冻过程中因温度变化造成的损伤，包括甘油、乙二醇、二甲基亚砜（DMSO）等渗透性冷冻保护剂，以及单糖（葡萄糖）、双糖（乳糖、蔗糖、海藻糖等）、三糖（棉子糖等）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等非渗透性冷冻保护剂。有研究表明，添加二糖（乳糖、蔗糖、乳果糖、海藻糖或蜜二糖）比添加单糖冷冻保护作用更好。另外，在配方中可能不同类型的糖发挥着不同的作用。其他保护剂是保护精子不受各种不良环境因素的危害和改善精子所处环境的理化特性而添加的物质，如缓冲剂（磷酸二氢钾、柠檬酸钠、三羟基甲氨基甲烷等）、抗氧化剂（谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、过氧化物酶、褪黑素、丁羟基甲苯等）、抗生素（青霉素、链霉素、庆大霉素等）等。尤其特别指出的是氨基－钠－十二烷基硫酸酯（Orvus ES Paste，OEP），该物质是一种表面活性剂，含有十二烷基硫酸钠（SDS）的复合物，OEP可防止低温对精子的损伤，对精子膜结构有保护、修补作用，能够提高猪冷冻精液解冻后精子活力、存活率及质膜完整率。关于OEP对精子保护作用的机理有两种假设：其一是OEP具有乳化类脂的作用，对精子膜结构中的类脂有稳定作用，降低或阻碍由冷冻保存所引起的似获能性变化；其二是OEP通过分散卵黄中的类脂物并形成聚合体使这些类脂物更易进入精子质膜，而不是直接作用于精子膜结构，即OEP发挥作用的前提必须有卵黄存在。目前几乎所有高品质猪冷冻精液稀释液的配方中均含有OEP和卵黄。
  2.2.4 冷冻剂型
  冷冻剂型指精液在冻前用不同的载体分装或冷冻成不同的形状。在冻精的发展历程中，研究人员尝试过制作颗粒冻精、塑料细管、玻璃安瓿、扁平袋等不同的冻精剂型。
  各种剂型在制作、标记、冷冻、保存及应用等方面各有利弊。颗粒冻精制作简单，取用方便，但制作过程中容易受到环境的影响，不能完全做到洁干净卫生，而塑料细管冷冻精液可以克服这一缺点，另外由于细管容积小、管壁薄适于快速冷冻且冷冻均匀，在快速解冻时升温一致，提高了解冻后精子活力，进而提高了配种受胎率。细管冻精喷码清楚明确，可以进行详细记录，而且不易磨掉，避免喷码信息差错，防止系谱混淆；细管型冷冻精液可全自动机械化生产，能够做到剂量标准化，提高了生产效率。塑料/金属扁平袋质地非常薄、表面积大，可以在冷却过程中快速降温，在解冻过程中快速升温，其冻存效果方面不低于0.25?mL细管冻存，再加上可容纳子宫颈输精单次所用的5 mL精液（50亿精子），省去了解冻时汇集无数细管的操作，输精后产仔率和产仔数在可接受的范围内，该方法的缺点是精子利用效率不高，每次采精可配母猪的数量不多。随着子宫角输精技术的成熟，所需精子数量大大减少，可以使用容量更小（0.5～0.7 mL）的扁平袋来冷冻密度更高的精子，即“MiniFlatPack”（MFP）法冷冻精液，MFP冷冻不仅比冷冻液细管的冷冻更均匀，而且精子冷冻存活率更高，当使用宫内深部人工授精时，受胎率也不低于0.5 mL的细管冷冻。
  现在国内外大部分的猪冷冻精液产品都采用0.5 mL的细管冻精，采用颗粒冻精占比例很小，其他剂型也很少使用。
  2.3 猪冷冻精液技术研发、推广、应用中存在的问题我国猪精液冷冻保存技术在技术研发、推广及应用方面存在“三乱、三难”现象。
  “三乱”首先指的是研发乱。长期以来，由于猪冷冻精液质量不过关，母猪受胎率和产仔数偏低，导致国内对猪精液冷冻保存技术的研发进展缓慢，对影响猪冷冻精液质量的各种因素缺乏系统性和持续性探索，对冷冻损伤机理研究不深入，缺乏与使用实践相配套的理论支撑。发表的猪冷冻精液技术相关数据凌乱，综述性文章多，且内容雷同，科研性论文少，成果不能应用于生产；其次是开发乱。企业开发的猪冷冻精液产品质量没问题，但在产品的推广中过分地宣传冷冻精液带来的经济效益，当效益达不到预期目标时，就会对猪冷冻精液产品甚至猪冷冻精液技术产生质疑，忽略了猪冷冻精液的优点是多种因素相结合的产物；三是应用乱。应用效果在企业宣传小群体验证时效果好，但实际大群体应用时效果差，售后服务人员指导使用效果好，客户独立使用效果差。
  “三难”首先是冻精用种公猪筛选难。猪精子耐冻性的个体差异性很大，但常规的精液检测技术不能检测公猪精子耐冻性，用实际多点大群体输精工作量大、耗时长，不利于猪冷冻精液的商业化运营；其次是生产难。冷冻稀释剂不能自主配置，以外购为主，昂贵的专业猪冷冻精液生产设备也限制了中小规模猪冷冻精液生产的企业和个人的进入，全国能独立生产质量合格猪冷冻精液的机构屈指可数；三是应用难。在物流运输如此发达的今天，专业化的猪冷冻精液的派送尚未解决，只能大量采购后由生产企业专门送货，造成了冻精价格偏高，限制了生产应用。
  3  展望猪冷冻精液
  从唯物论发展观的角度来看，猪冷冻精液是猪精液保存技术的发展。而发展具有普遍性、前进性和曲折性。随着猪冷冻精液生产及应用技术的逐步成熟，未来猪冷冻精液应用将会得到逐步提升，也会成为国际和国内种猪遗传资源交流的重要手段。而极端情况的出现也会促进猪冷冻精液的应用。但公猪精液的抗冻性筛选、冷冻机制的研究、冷冻精液的生产体系、输精方法和推广体系等诸多影响因素仍需进一步完善。
  3.1 冷冻前对公猪抗冻性进行筛选
  传统的精子评定方法无法预测精液抵抗冷冻的能力，因此需要研究者专注于抗冻性标记的筛选与鉴定，抗冻性标记被定义为在开始冷冻保存之前，那些可能允许在新鲜/稀释精液中鉴定GFE和PFE的标记（蛋白质或非蛋白质）。
  研究发现，精子的卵母细胞结合蛋白GSTM3、白蛋白（ALB）和蛋白质二硫化物异构酶家族A成员4（PDIA4）、热休克蛋白90（HSP90AA1）、顶体蛋白结合蛋白（ACRBP）、磷酸丙三糖异构酶（TPI）、电压依赖性阴离子通道蛋白2（VDAC2）等精子蛋白的相对含量与冻融精子质量参数之间存在显著相关性，可作为新的抗冻性标记。
  在基因组水平上，猪GFE和PFE组之间存在多达16个潜在的遗传标记，这表明遗传差异可能是这些抗冻性差异的基础。这一发现似乎并不是猪独有的，因为HSP70 191位的单核苷酸多态性，特别是C>G，与山羊较高的精子抗冻性也相关。
  另外，添加来自GFE的精浆蛋白增加了PFE的抗冻性，说明精浆中存在某些抗冻性成分，用差分凝胶电泳（DIGE）比较了GFE和PFE组精浆蛋白质组的差异，发现纤连蛋白1（FN1）可作为公猪精液的抗冻性标记。另一种似乎赋予公猪精液更高低温耐受性的精浆蛋白是N-乙酰-β-己糖胺酶，精液解冻后该蛋白的活性与精子活力、活力和脂质过氧化呈负相关，因此公猪精浆中较高水平的N-乙酰-β-己糖胺酶活性与精子低温耐受性低有关。
  基于目前的研究进展，亟需对猪精子抗冻性标记进行筛选和大群验证，随着高通量技术的发展，可以利用SNP芯片可以在公猪群体种进行选育，但存在的障碍是抗冻性蛋白是否存在种间的差异和公猪群体规模，因此需要国内各机构联合协作，尽早确定切实有效的抗冻性标记，用于公猪早期选育。
  3.2 深入开展冷冻损伤机制的研究
  众所周知，细胞代谢在低温下会降低，正是利用了这一特点，才可以在冷冻条件下长期保存生殖细胞、胚胎和组织。
  精子细胞和细胞外液体在-5℃下保持未冷冻和过冷状态，在-5℃到-15℃的温度区间内，细胞周围的液体中会形成冰，但细胞内内容物仍然未冻结，仍处于过冷状态。由于水在过冷（细胞内）状态下的化学势比在冷冻（细胞外）状态下更高，所以水会从细胞中流出并在细胞外部冷冻，因此冷冻速率决定了冷冻效果。如果冷却速度非常高，细胞内的水不会完全流出，在细胞内冻结形成冰晶最终导致冷冻损伤。由于细胞内冰晶的形成不仅取决于冷却速度和温度，还取决于冷冻保护剂浓度，因此使用合适的冷冻保护剂可以缓解冷冻损伤。如果冷却速度很低，大部分水会流出，细胞内溶质会被浓缩，过冷会被消除，细胞处于脱水状态。细胞器和膜的体积收缩，并在达到所有溶液成分固化的温度之前暴露于高溶质浓度下，从而使脂蛋白复合物等使大分子变性，减少未冻结通道的大小，并诱导不可逆的膜融合。由此产生的高渗应力会改变电解质平衡，这可能导致细胞膨胀超过其正常等渗体积，随后在解冻时裂解。因此，高速冷冻和低速冷冻都可能导致细胞冷冻损伤，形成了冷冻损伤双因素理论：a）由于在高冷却速率下细胞内冰的致命形成，b）由于溶质/电解质浓度，细胞脱水以及在低冷却速率下细胞外空间中未冻结部分的减少。对于每种特定的畜禽类型精子都存在最佳冷却速率，并且该冷却速率被定义为低至足以避免细胞内冰的形成，但又足够高至以最大限度地减少由于溶质/电解质浓度引起的冷冻损伤。
  基于上述研究，需要采取添加高效而又不对精子造成损伤的冷冻保护剂、筛选合适的冻融速度、添加抗氧化剂降低冷冻对精子的氧化损伤、冷冻前进行渗透平衡、完善冷冻稀释剂配方、采用合适的剂型、稀释液渗透压的筛选、添加表面活性剂等多种措施来尽可能降低冷冻损伤。这就要求国内冻精研究和生产企业在目前已有配方的基础上进行联合攻关，开发自主知识产权的稀释液配方，突破关键因素，从物理、化学、生物学等多角度进行冷冻损伤机制的研究。
  3.3 建立标准化的猪冷冻精液的生产体系
  国家标准GB／T 3951—83对标准化下的定义是：“在经济、技术、科学及管理等社会实践中，对重复性事物和概念，通过制定、发布和实施标准，达到统一，以获得最佳秩序和社会效益。”通过标准化生产流程的实施，可以达到提高质量、增强安全性、促进可持续发展等目的。猪冷冻精液生产体系规范化和标准化将会规范猪冷冻精液的生产流程，确保生产过程的安全、高效，并能生产出符合生产实际需求的质量合格的猪冷冻精液产品。
  冷冻精液的生产体系涵盖精液采集、品质鉴定、平衡、去精浆、稀释、再平衡、灌装、冷冻、冻存、解冻、人工授精等多个步骤，每个步骤都对精液冷冻效果具有影响，因此需要对它们进行标准化操作，建立详细的技术参数。
  3.4 建立猪冷冻精液精推广体系
  目前冷冻精液的应用比例仍很小，很多结果仍基于小群母猪输精验证，缺乏多点、大群输精效果评价，因此各猪冷冻精液精研究和示范单位应该联合对冻精输精后的母猪怀孕率、产仔率进行评价，及时将结果反馈给冷冻精液生产单位，用于冷冻方法、生产技术体系的优化。
  猪自身的生物学特性决定了如果采用子宫颈口输精，一次输精需要用到很多个细管冷冻精液，操作不便。子宫体输精、子宫角输精对操作人员的技能要求较高，如果不经过系统的学习和训练，很难在短时间内完成输精操作，因此一定要对输精人员进行培训、考核和技能比赛，提高其操作能力，这也是猪冷冻精液精利用和推广过程中重要的任务之一，不能设置技术壁垒，只有基层人员和猪场技术人员掌握了技术，才能在生产中利用猪冷冻精液。
  猪冷冻精液的物流运输体系匮乏也是制约利用和推广的因素。利用各省市防改站、畜牧站、种畜中心，和奶牛、肉牛冻精和冻胚一起配送可能是目前解决该问题的途径之一。建立全国性的专用的猪冷冻精液精物流运输系统仍存在很大困难，猪冷冻精液精研究和生产企业联合起来，互通有无，在养猪集中区建立区域性的猪冷冻精液精生产和储存中心可能成为必然。
  通过冻精输精效果多点大群验证、输精技术人员的培训、猪冷冻精液精配送体系建立，必将推动猪冷冻精液的高效利用。