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邹盼盼1，王春江2，曹省艳3
杨阳1，王迈4，齐雪峰1
(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.河北威远药业有限公司，河北石家庄 050000；3.绵阳市动物疾病预防控制中心，四川绵阳 621000；4.石家庄市农业综合行政执法支队，河北石家庄 050000)
摘要
为研究百里香酚、肉桂醛、香芹酚配制的复合植物精油(奥来可)对仔猪生长性能和肠道的影响，试验选择三元杂交的断奶仔猪，随机分为对照组和试验组，分别饲喂基础日粮和基础日粮+植物精油500mg/kg，试验期60d。结果表明，试验组断奶仔猪平均日增重、平均日采食量均显著高于对照组(P<0.05)，腹泻率显著低于对照组(P<0.05)，料重比低于对照组；试验组仔猪肠道长度和小肠长度均极显著大于对照组(P<0.01)；试验组仔猪十二指肠、空肠、回肠绒毛高度均极显著高于对照组(P<0.01)；试验组仔猪十二指肠隐窝深度极显著低于对照组(P<0.01)，空肠隐窝深度显著低于对照组(P<0.05)；试验组仔猪十二指肠、空肠绒隐比均极显著高于对照组(P<0.01)，回肠绒隐比显著高于对照组(P<0.05)。试验组仔猪十二指肠和直肠内有效序列均明显多余对照组；在属水平上试验组仔猪十二指肠罕见小球菌属、未分类柄杆菌科、罗姆布茨菌未分类消化链球菌科含量显著高于对照组(P<0.05)；直肠内梭菌属6、土孢杆菌属含量显著高于对照组(P<0.05)，链球菌量显著低于对照组(P<0.05)。说明由百里香酚、肉桂醛、香芹酚配制的复合植物精油能明显提高仔猪生产性能，促进肠道生长发育，改善十二指肠、直肠微生物区系，减少致病菌量。
关键词：植物精油；断奶仔猪；生长性能；肠道结构；菌群结构
在生猪养殖业中，仔猪出生后 3~5 周实施断奶极易产生应激反应，主要表现为精神萎靡、食欲不振、腹泻或者其他肠道疾病，甚至导致死亡[1]。随着集约化养殖的发展，虽然生产实践中通过在日粮中添加抗生素可有效改善仔猪断奶应激，但长期使用抗生素会蓄积于动物体内，并且残留在各种动物性食品中，威胁食品安全且污染环境。除此之外,还会产生细菌耐药性问题，形成恶性循环[2]。我国于2020年7月禁止一切抗生素药物应用于饲料添加剂。因此，探寻绿色、高效的抗生素替代产品对我国养猪产业健康可持续发展具有重要意义[3]。现广泛应用的抗生素替代药物有植物提取物[4]、酸化剂[5]、酶制剂[6]等。植物精油(plant essential oils,PEO)是从各种植物中提取的具有抑(杀)菌、抗炎、抗氧化等作用的活性物质。目前在畜牧业上应用最为广泛的 PEO 有 3 种，分别为百里香酚、香芹酚和肉桂醛，其中百里香酚主要来源于百里香、牛至，香芹酚主要来源于中草药牛至，肉桂醛是中药肉桂的主要活性成分[7-9]。
有研究指出，在断奶仔猪基础日粮中添加250 mg/kg的百里香酚和香芹酚，能显著提高断奶仔猪的生长性能和对营养物质消化吸收的能力[10]。但也有不同研究结果指出,在断奶仔猪基础日粮中添加 500 mg/kg 百里香酚或者 18 mg/kg 的百里香酚和肉桂醛均不能显著提高仔猪的生长性能，但能显著提高仔猪免疫能力，降低腹泻率[11-12]。由此可见,不同种类的植物精油、不同添加水平,对断奶仔猪的效果也不同。此外，有研究表明，在畜禽日粮中添加牛至精油(有效成分为百里香酚和香芹酚)能改善仔猪肠道菌群结构[13]。在早期断奶仔猪日粮中添加 0.3%肉桂醛或 0.5%香声酚，均能提高仔猪肠道内乳酸杆菌的丰度，降低肠杆菌的含量，降低仔猪腹泻率[14-15]。
在无抗养殖背景下，传统中药在养殖领城逐渐为人们所接受，PEO 作为替抗产品受到越来越多的关注，然而现有的文献支持以单体精油为多，对复合植物精油在畜禽生产上的研究偏少。因此，为推广复合植物精油在养猪产业的合理应用，本研究选用由百里香酚、香芹酚和肉桂醛配制的复合植物精油为研究对象，将其添加到断奶仔猪日粮中，探究其对断奶仔猪作用60d后，对仔猪生长性能和肠道结构的影响。
1、材料与方法
1.1 材料
1.1.1 复合精油主要成分 百里香酚、肉桂醛、香芹酚三者配比为 1:1:1。
1.1.2 主要试剂 百里香酚、肉桂醛、香芹酚，河北威远药业有限公司产品；10%福尔马林、HE 染色试剂盒，北京索莱宝科技有限公司产品；无水乙醇，成都市科隆化学品有限公司；二甲苯，广东省化学试剂工程技术研究开发中心产品；DNA 抽提试剂盒(E.Z.N.A.?Soil DNA Kit)，美国Omega Bio-Tek公司产品；琼脂糖(biowest agArose)，西班牙biowest公司产品；FastPfu Polymerase，中国 TransGen 公司产品；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit ( Axygen Biosciences)，美国Axygen公司产品；建库试剂盒(NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit)，美国 Bioo Scientific 公司产品；测序试剂盒(MiSeq ReagentKit v3/NovaSeq Reagent Kits)，美国 Illumina 公司产品。
1.1.3 主要仪器 移液器(Eppendorf N13462C)、小型离心机(Eppendorf 5430 R)、高速台式离心机(Eppendorf 5424R)，德国 Eppendorf 公司产品；小型离心机(ABSON MiFly-6)，合肥艾本森科学仪器有限公司产品;超微量分光光度计(NanoDrop2000),美国Thermo Fisher Scientific 公司产品；酶标仪(BioTek ELx800)，美国 Biotek 公司产品；旋涡混合器(QL-901)，海门其林贝尔仪器制造有限公司产品；粉碎研磨仪(TL-48R)，上海万柏生物科技有限公司产品；电泳仪(DYY-6C)，北京六生物科技有限公司产品; PCR 仪(ABI Gene-Amp@ 9700 型),美国 ABI 公司产品;测序(Illumina Miseg),美国 Illumina 公司产品；正置显微镜(Ni-U)，日本尼康公司产品；超薄切片机(EMUC7)，奥地利徕卡仪器有限公司产品;1.2 方法
1.2.1 试验设计与饲养管理 选用 22 日龄断奶、体重相近的大白×长白×杜洛克三元杂交阉公猪，随机分为两组，每组10头，群栏饲养。对照组和试验组分别饲喂基础日粮和添加复合植物精油的试验日粮，添加量为500 mg/kg。各组均处于同一饲养条件下，预试验7d，正式试验期为60d，由专业人员进行饲养并定期记录试验数据，试验期内全部试验仔猪饮水采食自由，正常免疫，定期对猪舍进行消毒。
1.2.2 试验日粮 基础日粮参照中国瘦肉型生长猪饲养标准(2004)配制。
1.2.3 生长性能 分别于试验正式开始和结束时对每组仔猪空腹称重,记录初重、末重、日采食量，计算平均日采食量(average daily feed intake,ADFI)、平均日增重(average daily gain,ADG)、料重比(F/G)。同时记录每栏每天仔猪腹泻头数和死亡情况，计算仔猪腹泻率。
1.2.4 肠道样品采集与处理 于试验结束时，每组随机选择 4 头仔猪，屠宰后，打开腹腔分离肠道，暴露直肠，在骨盆腔中单结扎，取出全部肠道。再按十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠等不同肠段分别进行两端结扎并分离各段消化道。然后用灭菌剪刀从肠道各段截取约 2 cm X 2 cm(各肠段分别采集 2~3份作为试验和备份)，用无菌生理盐水将上述组织内壁轻轻冲洗干净，至内壁没有肉眼可见的黏附内容物为止，放入10%福尔马林密封编号后保存。
用灭菌医用剪刀从十二指肠、直肠中部剪开一个小口，再用灭菌药勺挖取大约 2 g 内容物分装到已灭菌的 2 mL冻存管中(各肠段分别采集 2~3 份作为试验和备份),编号、旋紧螺盖后迅速放入液氮或一80C超低温冰箱中保存待用。
1.2.5 肠道长度的测量与肠道组织苏木精-伊红染色 将完整取出来的肠道放到试验台，及时测量肠道长度。然后将固定的肠组织取出，参照常用的实验方法来制作石蜡切片,试验步骤包括冲水、脱水、透明、包埋切片和苏木精-伊红(hematoxylin-eosin.HE)染色。每组选取3个样品切片，低倍镜下(4X)每张切片选出5个典型的视野观察肠黏膜形态，观察过程中应注意所选取的肠绒毛长度应该基本一致，通过正置显微镜进行拍照。运用软件 Image-J测量绒毛的高度、隐窝的深度，并计算出绒隐比。
1.2.6 测序 将采集的十二指肠、直肠内容物送往上海美吉生物医药科技有限公司测序,通过美吉生物云平台对测序结果进行交互分析。
1.2.7 数据整理与分析 先通过 Excel2016 对初始数据进行整理，然后对断奶仔猪生长性能和肠道结构影响部分,结果通过 SPSS 19.0 统计软件进行 t 检验，以最小显著性差异法(least-significant differ-ence,LSD)进行多重比较，结果均以平均值 ± 标准误(Mean ± SE)表示；对断奶仔猪菌群结构影响部分，结果进行 Wilcoxon 秩和检验，结果均以平均值士标准差(Mean ± SD) 表示。以 P<0.05 表示差异显著。
2、结果
2.1 植物精油对仔猪生产性能的影响
由表 1可知，与对照组相比，试验组仔猪 ADG、ADFI均显著高于对照组(P＜0.05)，仔猪腹泻率显著低于对照组(P<0.05)，F/G 低于对照组。
2.2 植物精油对仔猪肠道长度的影响
由图1C和图1F可看出，试验组断奶仔猪肠道全长和小肠长度都极显著大于对照组(P<0.01)，说明植物精油能明显促进仔猪肠道发育，尤其是小肠，更好的消化吸收日粮中各种营养物质。
2.3 植物精油对断奶仔猪肠道组织形态结构的影响由图２可得出结果，试验组仔猪十二指肠绒毛高度和绒隐比均极显著高于对照组(P＜0.01)，隐窝深度极显著低于对照组(P＜0.01)；试验组仔猪空肠绒毛高度和绒隐比均极显著高于对照组(P＜ 0.01),隐窝深度显著低于对照组(P＜0.05)；试验组回肠绒毛高度极显著高于对照组(P＜0.01)，绒隐比显著高于对照组(P＜0.05)，而在降低肠隐窝深度上，与对照组间没有显著性差异。说明植物精油可明显促进断奶仔猪小肠生长发育。
2.4 植物精油对仔猪肠道菌群结构的影响
2.4.1 韦恩图 试验组仔猪十二指肠(图 3A)、直肠(图3B)内可检测到的ASV序列均多于对照组，说明试验组仔猪十二指肠、直肠内菌群种类多余对照组。
2.4.2 肠道菌群属水平变化 由表 2 可看出，与对照组相比，试验组断奶仔猪十二指肠内罕见小球菌属、未分类柄杆菌科(unclassified-Caulobacterace-ae)、罗姆布茨菌(Romboutsia)、未分类消化链球菌科(unclassified-Peptostreptococcaceae)含量显著高于对照组(P<0.05)；乳杆菌属含量显著低于对照组(P＜0.05)。且试验组断奶仔猪十二指肠内特有菌属有普雷沃氏菌科 NK3B31群(PrevotellaceaeNK3B31-group)、RF39、梭菌属 UCG-014( norank-Clostridia-UCG-014)。与对照组相比，试验组断奶仔猪直肠内狭义梭菌属 6、土杆菌属含量显著高于对照组(P＜0.05)；链球菌属、罕见小球菌属含量显著低于对照组(P<0.05)。
3、讨论
3.1 植物精油对仔猪生产性能的影响
大量研究表明，在日粮中添加植物精油能改善备禽的生产性能。Tan 等[16]在妊娠母猪饲粮中添加牛至油，可显著提高后代仔猪平均日增重；方秋红等[17]研究发现饲喂含有50mg/kg肉桂油的日粮可明显提高断奶仔猪平均日采食量和平均日增重，降低料肉比；张勇等[18]研究表明在断奶仔猪基础日粮中添加三丁酸甘油醋和牛至油,能显著提高仔猪平均日增重，极显著降低仔猪腹泻率。此外，有研究指出仔猪腹泻的本质是肠道发育不健全，上皮不能正常转运营养物质，同时肠道的屏障功能受损，导致肠腔内不能被消化吸收的可溶性代谢产物增多[19]。本研究结果显示，添加百里香酚、肉桂醛、香芹酚复合精油断奶仔猪的平均日采食量和平均日增重都明显高于基础日粮对照组，且料肉比和仔猪腹泻率低于对照组，说明日粮中添加百里香酚、肉桂醛、香芹酚复合植物精油能明显提高仔猪生产性能，提高饲料报酬，改善仔猪腹泻。
3.2 植物精油对断奶仔猪肠道发育的影响
肠道发育情况对断奶仔猪生长有至关重要的作用,小肠是消化吸收日粮中营养物质的主要场所，其中十二指肠、空肠和回肠黏膜是动物正常生长和消化吸收的生理基础。小肠绒毛主要负责吸收功能肠隐窝(小肠腺)主要是分泌功能[20]。肠绒毛高度肠隐窝深度及二者比值可反映小肠的功能状态，肠绒毛高度与小肠吸收功能成正比，而肠隐窝深度与之成反比[21]。本研究结果显示，试验组仔猪肠道全长和小肠长度均极显著大于对照组(P<0.01)；十二指肠和空肠绒隐比极显著高于对照组(P<0.01)。说明该复合植物精油能明显促进断奶仔猪肠道发育，有效改善小肠组织结构，增大小肠绒毛的接触面积，降低未成熟细胞占比，提高肠道对日粮中营养物质的转运、消化和吸收。
3.3 植物精油对断奶仔猪十二指肠和直肠肠道菌群结构的影响早期断奶仔猪的消化系统发育不健全，消化和分泌能力不足，不能有效吸收营养物质,极易发生肠道内菌群失调,导致腹泻甚至死亡[22]。本研究通过对细菌 16S rRNA 基因进行高通量测序，Venn 图结果显示,试验组断奶仔猪十二指肠、直肠内有效序列均明显多余对照组，说明植物精油能明显影响断奶仔猪十二指肠、直肠内菌群结构。
研究指出普雷沃氏菌属[23]、毛螺菌属[24]、UCG005[25]都是典型的纤维降解菌，能降解饲粮中纤维成分,利用多糖产生短链脂肪酸,促进肠道发育。梭菌属、乳杆菌属、土抱杆菌属都属于厚壁菌门,梭菌属能分泌蛋白酶和基胀酶，降解日粮中蛋白质成分[26]。除此之外,梭菌属家族部分成员不仅能促进营养物质代谢,与肠道健康也有密切关系,健康肠道内梭菌属和土抱杆菌属丰度更高[27-28]。Wilhelm RC 等[29]研究指出未分类柄杆菌科能明显降解所有木质纤维素聚合物，说明该菌属能有效分解饲粮中的粗纤维;乳杆菌属和双歧杆菌属是已被证实的肠道益生菌，能改善仔猪断奶后胃酸分泌不足的情况创造肠道酸性环境，抑制致病菌(如沙门氏菌)生长[30]。研究结果指出中药汤剂可通过上调罗姆布茨菌[31]、消化链球菌属[32]的含量，调节肠道菌群结构，同时抑制大肠杆菌志贺氏菌的生长。
前期精油体外抑菌试验结果表明，百里香酚和肉桂醛对致病菌和益生菌均有抑菌作用，香芹酚对致病菌的抑制作用最强，但对益生菌没有抑菌作用：3 种单体精油等比例混匀后，对致病菌的抑菌作用明显强于益生菌。本研究结果说明添加百里香酚肉桂醛、香芹酚复合植物精油能显著上调十二指肠内能降解日粮中粗纤维、粗蛋白、利用多糖的菌属为仔猪断奶之后提供能量和营养,促进生长发育 ;上调断奶仔猪直肠内乳杆菌属、梭菌属、土抱杆菌属含量，显芝减少链球菌等常见的肠道致病菌的含量(P<0.05)，与前期研究结果一致,说明该复合植物精油能明显断奶仔猪直肠内益生菌生长，同时抑制致病菌的生长，改善肠道内菌群体系。
综上所述，该复合植物精油能明显改善断奶仔猪肠道微生物体系，上调可分解基础日粮中纤维和蛋白等成分的菌属和有益于肠道健康的菌属，减少仔猪腹泻，缓解仔猪断奶应激。
参考文献（略）
来源：威远药业
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