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猪主要疫病的生物制品开发机会和策略
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2024/1/26 19:44:19 关注：275 评论： 我要投稿
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猪养殖业是重要的民生行业，其中对猪场的疫病防控是养殖管理的重要工作内容。从目前猪疫苗的供应看，大部分的猪疫病都有疫苗产品可使用。但仍存在有重大疫病无药可用或无有效防控手段的情况，尤以非洲猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和仔猪腹泻综合征为代表。
一、 猪的主要疫病
2018年，非洲猪瘟病毒传入中国猪场，生猪养殖行业出现剧变，目前，主要猪疫病有：
非洲猪瘟（ASF）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）、产房仔猪腹泻综合征、猪口蹄疫（FMD）、猪瘟（CSF）、猪伪狂犬病（PR）、猪圆环病毒2型（PCV2）、细菌性疫病。从目前疫苗的供应看，基本所有的疫病都有疫苗产品可使用。但仍存在有重大疫病无疫苗或无有效疫苗可用的情况、有对猪群健康造成巨大伤害但是现有疫苗和防控手段收效较低的疫病，例如，非洲猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征和仔猪腹泻综合征。
二、非洲猪瘟
2.1、ASFV疫苗研发的难点
2.1.1、对于ASFV病毒粒子研究不够
基因组庞大、基因型众多且易发生重组无疑增添了疫苗的研发难度：ASFV是呈现二十面体多层包裹结构、平均直径约200nm的双链 DNA 病毒，庞大的病毒粒子和多达200多个开放性阅读框使对其的结构解析工作难度较大。
ASFV在胞内外都具有传染性，其在胞外增加了一层外囊膜，说明很可能外囊膜上也有病毒侵染关键抗原；其在胞内的传染通路已经被证明是多通路的；其即使只剩下最内层的类核也具备感染性，说明其最内层也具备关键抗原。除了知道多层结构都具备的关键抗原，还需要了解关键抗原的作用方式。
2.1.2、对于ASFV侵染机制不够了解
ASFV入侵宿主细胞的机制复杂多样，具体方式和细节尚未完全知悉，但较多地观察到胞吞和巨噬细胞吞噬的入胞路径。其在细胞内解体、重组中蛋白对于细胞内多个免疫通路的抑制机理尚未可知，但可以明显地观察到ASFV感染猪只免疫力降低。
2.1.3、ASFV基因型众多，易发生同源重组
目前已经发现基因型不少于24个，国内目前以基因II型流行为主。变异较快，导致传统技术路线下疫苗的有效性会降低。
2.2、现有ASFV疫苗开发技术比较
2.2.1、ASFV疫苗因其致病性致死率高，弱毒苗是不够安全的路线ASFV属于烈性传染病病原，安全性是疫苗研发过程中的首要考虑因素；但是多项田间试验失败在一定程度上反应了弱毒疫苗的可行性差或不可行。
2.2.2、ASFV亚单位疫苗制苗起始于抗原选择，如何更好地获得用于免疫的优质抗原是提高疫苗蛋白组分免疫原性的关键直接定义关键抗原组合、通过体外表达获得优质抗原作为疫苗组分，产品更可控。
三、猪繁殖与呼吸综合征
3.1、蓝耳病概述
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的猪的一种免疫抑制性疾病，又称“猪蓝耳病”。PRRSV主要感染单核巨噬细胞系统，尤其对猪的肺泡巨噬细胞具有专噬性，导致感染PRRSV的猪只出现免疫抑制现象。
猪蓝耳病易引起母猪繁殖障碍，导致流产、死胎、木乃伊胎。还容易使各年龄段的猪群感染呼吸道疾病，特别是仔猪。其传播速度快、防控难度大。
3.2、为什么猪蓝耳病如此难以控制呢?
① 病毒极易变异、重组；
② 持续感染，排毒期时间长；
③ 垂直传播，可通过胎盘屏障直接感染胎猪；④ 抗体依赖性增强（ADE）；
⑤ 蓝耳病的中和抗体产生延迟；
⑥ 诱导炎症反应，导致机体出现严重的临床症状；⑦ 强烈的免疫抑制，造成机体抵抗力下降。
3.3、 由于蓝耳病是针对所有年龄段的猪，不同猪群感染蓝耳病和发病的原因是什么？
① 在蓝耳病阳性猪场，母猪是最主要的传染源；② 对于哺乳仔猪，蓝耳病主要经由母猪垂直传播，导致仔猪感染发病；③ 对断奶仔猪和生长育肥猪，病毒可长时间在猪群循环，造成猪群持续感染和发病。
3.4、造成猪场蓝耳病容易不稳定的因素
① 猪场存在高致病性蓝耳病病毒；
② 猪场有多个毒株共存；
③ 从场外引入新毒株，或场内出现新的毒株；④ 蓝耳病疫苗滥用。
3.5、蓝耳病既然是困扰养猪业最大的疫病之一，它的免疫困境是什么？
作为一个尚未有非常有效的疫苗保护的疫病，行业对蓝耳的免疫困惑主要体现在：
① 使用活疫苗，担心安全有问题；
② 使用灭活疫苗，担心效力不够；
③ 不使用疫苗，担心无法阻止病原感染致病问题；④ 使用现有的疫苗，担心对NADC30或NADC34类毒株无效；⑤ 使用现有的疫苗净化，担心无法监测野毒传入感染问题；⑥ 不使用疫苗净化，担心代价过高和净化后死灰复燃问题。
本质上，是因为现有蓝耳疫苗产品的安全性和有效性没有取得好的平衡（活苗存在与野毒重组的问题，灭活苗存在免疫效力低的问题）且有效性水平较低，另外，免疫后净化效果难以维持。
3.6、但在疫病难防，需要多方面加强疾病防控和管理下，依然需要考虑蓝耳疫苗的使用。如何选择蓝耳病疫苗？为什么说存在蓝耳病疫苗滥用的问题？
3.6.1、是否应该免疫蓝耳病疫苗？
由于蓝耳病在全国渗透率很高，因此蓝耳病的免疫渗透率也比较高，但是由于蓝耳疫苗尚未能针对蓝耳病病毒的特点解决蓝耳病防控问题，导致一些人认为蓝耳病不应该免疫。但其实，选择不免疫蓝耳病疫苗，是因为一些猪场的规模不大、一个猪舍内各个生长阶段的猪都有，又不能做到批次化管理，很容易导致交叉感染，其次，针对没有感染蓝耳病的猪场（蓝耳病因为病毒毒株变异广泛，有无感染最好使用qPCR核酸检测），可以不免疫。但是由于蓝耳病是一种免疫抑制性疾病，一直不免疫，可能会使得猪场中的小猪暴露于其它病原感染风险。
3.6.2、怎样选择免疫猪蓝耳疫苗？
目前中国国内销售的蓝耳苗分为灭活苗和减毒苗，其中减毒苗的毒株分两大类，即经典株（VR-2332、CH-1R、R98）和高致病株（也称变异株，江西株、湖南株、天津株），经典株更稳定，毒力更弱。灭活苗已经被公认为无效，而减毒苗被验证是有效的。减毒苗中，根据国际基因组数据库的结果，高致病株（江西株、湖南株、天津株）全基因组同源性99%，实际销售使用尤以天津株为主；而经典株近年来卫生调查发生占比再提高，也导致其销售开始重新抬头增长。最有效的疫苗选择取决于猪场内的主要流行毒株。
3.6.3、蓝耳病疫苗是否存在滥用的问题？
是。滥用更多是从结果层面讲，即按照现有的免疫流程使用现有的蓝耳疫苗并不能很好地解决/清楚蓝耳病病毒，除了因为目前针对蓝耳病的疫苗开发仍然任重道远外、各方专家推荐的各不同的蓝耳病免疫程序多、哦、3.7、蓝耳病毒的特点是什么？是什么病毒特征导致它如此特别？
3.7.1、特别容易变异
PRRSV是单股正链RNA病毒，具有RNA病毒复制时缺乏校对机制的特点，其错误修复机制的酶的活性很低，几乎是没有的，在病毒复制时容易发生碱基缺失、插入、替换等突变现象，而且PRRSV具有多个高变区，使得病毒的突变率大大增加。
3.7.2、抗体依赖性增强（ADE）
病毒感染都是从黏附于细胞表面开始的, 黏附是通过病毒表面蛋白与靶细胞上特异性受体、辅助性受体分子的相互作用来完成的。病毒表面蛋白的特异性抗体常常可以阻抑这一步骤, 将病毒“中和”, 使其失去感染细胞的能力。然而在有些情况下, 抗体在病毒感染过程中却发挥相反的作用, 它们协助病毒进入靶细胞, 提高感染率。具体而言，即在首次进行病毒感染时，如果细胞环境中有预先存在的亚中和浓度的病毒特异性抗体（通常是IgG抗体），那么病毒的滴度会更高。
而蓝耳病毒的GP5、M和N蛋白在感染早期诱导产生的非中和抗体能引起PRRSV的抗体依赖性增强。
PRRSV在体内外均表现出ADE现象，而妊娠后期的胎儿已经出现主动免疫应答，但此时形成的抗体对跨胎盘感染的PRRSV的ADE，可能是母猪妊娠后期流产的主要原因之一。另外，仔猪对PRRSV的高易感性归咎于亚中和抗体水平母源抗体的存在，这些都提示PRRSV致病机制可能与ADE有关，其原因可能就是病毒与抗体形成免疫复合物后，借助细胞表面的Fc受体与PAMs结合，从而有助于病毒侵染细胞。
我们知道，PRRSV感染早期，基本在1周左右产生的抗体均是针对GP5、M和N蛋白的非中和抗体，这些非中和抗体可以与入侵的PRRSV结合形成免疫复合物，进而与宿主细胞表面的IgG Fc受体结合，从而起到促进病毒感染的作用，因此，在进行疫苗免疫时，我们一定要注意免疫时间的把握。
3.7.3、中和抗体产生较晚
由于ADE效应存在，PRRSV的中和抗体在感染后很迟才会出现，由于PRRSV中和抗体产生缓慢且不规律，不能保证中和抗体在PRRSV保护性反应中的作用。在使用疫苗免疫后，中和抗体的产生在四周以后，干扰素的产生更慢。
3.7.4、免疫抑制现象
PRRSV感染可诱导机体快速产生高水平的特异性抗体，但感染后活化性Fc受体下调导致亲细胞抗体和抗原抗体复合物不能活化免疫效应细胞，从而引起细胞免疫功能下降，这可能是PRRSV免疫抑制的分子基础 。
3.8、既然现有蓝耳苗存在这样那样的问题，那新一代蓝耳疫苗研发策略应该是如何的？
对于蓝耳疫苗，加强细胞免疫的保护作用是方向之一，PRRSV减毒活疫苗诱导的抗体可能增强野毒株在猪体靶细胞内的复制，同时，野毒株产生的抗体可能会增加疫苗毒株的复制。这些都表明，体液免疫的保护作用对于抵御PRRSV感染是有限的，有时甚至是危险的，这可能也是尽管猪场普遍应用PRRSV减毒活疫苗或灭活疫苗，但PRRS疫情仍然频发的原因之一。大量研究已经表明，细胞介导的免疫在抗PRRSV感染中的作用远远大于体液免疫。
提高疫苗免疫产生的中和抗体水平，从而中和感染病毒粒子，回避抗体介导的抗体依赖性增强作用。
因此，要实现蓝耳疫苗更高的保护率，必须得保证其免疫诱导的抗体水平能达到相当高的水平，由于PRRSV感染后的抗体产生时间很长，所以要求免疫使用的疫苗本身的有效抗原含量足够高/抗体产生的水平足够高，才能缩短抗体产生的窗口期和减少ADE反应。
最好是不具备病毒复制能力的疫苗，蓝耳病的特别之处在于其特别容易发生重组变异，因此，疫苗毒株最好不具备病毒复制能力。这意味着活疫苗、活载体疫苗、嵌合毒株疫苗不应该成为重点研发方向。只要使用的疫苗毒株可在宿主细胞内复制，理论上都会有很高的与野生型毒株重组的概率，使得猪场的毒株变异更加复杂。
疫苗具备标记功能是必须的，由于蓝耳活疫苗容易与野毒发生重组变异，在猪场容易死灰复燃，因此能够区分野毒和免疫毒株B细胞表位片段消除或添加是必须的。通过区分自然感染和免疫接种动物，能够更好地掌握PRRSV在猪场的感染和防控情况。
3.9、可能选择的较好的研发方向是哪些？
基因缺失毒株：猪只免疫了PRRS疫苗之后，早期出现的针对N蛋白的抗体没有中和活性，对动物机体不产生保护作用，而有中和活性的中和抗体出现相对较慢，且水平很低，感染后2-5周甚至更长时间才能检测到。因动物机体的免疫应答机制及PRRSV刺激机体产生免疫应答机制的独特性，PRRS弱毒活疫苗比灭活疫苗更加理想。
传统的针对关键（结构）蛋白的研发技术路线可能对蓝耳疫苗不是一个有效的思路：蓝耳病病毒直径大概在45～60nm， 外型呈椭圆状。约带有6～7个结构蛋白， 关键结构蛋白有3个。病毒不大、蛋白不多，看起来似乎容易开发基于关键结构蛋白的亚单位疫苗乃至载体疫苗和mRNA疫苗。但针对PRRSV诱导中和抗体产生的病毒蛋白研究一直存在争议，不同毒株诱导中和抗体产生的蛋白存在差异。PRRSV在侵染猪细胞后，往往要数天才可以检测到中和抗体反应（2-3周以上）也导致整个PRRSV的研发工作很难去验证哪个病毒蛋白起到关键作用。
四、仔猪腹泻综合征
首先，需要澄清腹泻与猪流行性腹泻（PED）是两个概念。能够引起腹泻症状的疾病有很多，PED仅仅是其中最重要的一种，发生比例大约占腹泻疾病的60%左右。因此，免疫PEDV或PEDV变异株疫苗，仍有可能发生非PED导致的腹泻。
4.1、免疫过PED疫苗的猪场仍然有发病的原因是什么？
能够引起腹泻症状的疾病有很多，PED仅仅是其中最重要的一种。
即使发生的疾病是PED，但PEDV疫苗的免疫保护率也不是100%，甚至很差：猪场环境病毒载量过高、免疫方案不合适（可能毒株适配性、免疫流程有问题）、环境控制较差（温度、湿度等控制不当都可能会导致免疫后依然出现腹泻相关症状出现、持续。
4.2、 PEDV病毒的特点和其造成重大临床伤害的原因？
4.2.1、PEDV是通过粘膜感染的，尤其是肠道粘膜其传播途径主要是消化道粪-口传播，无需传播媒介。
4.2.2、从实际损害看，对仔猪、小猪，尤其是初乳期的仔猪伤害最大，就因为其未具备齐全的粘膜免疫系统母猪初乳中含大量的免疫球蛋白、生长因子及激素，对新生仔猪具有免疫保护作用，可保证其正常生长发育，在出生72小时后因量骤减而变为常乳。
初乳中的大部分乳蛋白（如IgG、单体IgA）由仔猪吸收后进入血液循环提供体液免疫，而免疫球蛋白sIgA则锚定在肠道黏膜上形成局部免疫；常乳乳蛋白主要为新生幼仔提供必需的氨基酸。PEDV是感染肠道黏膜的病毒，具肠道组织细胞嗜性，其传播途径除粪-口传播外，还可通过哺乳患病母猪的乳汁感染。PEDV感染后与肠道黏膜细胞表面的受体结合通过膜融合侵入宿主细胞，并介导机体产生中和抗体发挥免疫作用，其中主要介导sIgA和IgM发挥作用，产生的sIgA可分布在黏膜或浆膜表面筑起保护屏障。而怀孕母猪机体产生的sIgA还可经淋巴归巢和血液循环聚集于乳汁，新生仔猪通过母乳获取抗PEDV的sIgA以防仔猪流行性腹泻的发生。因此，只有充分了解sIgA产生和作用机制，并且新生仔猪只有吸吮无PEDV病原体且高sIgA滴度的母猪初乳才具有免疫保护力。
PEDV是感染肠道黏膜的病毒，黏膜免疫是机体抗PEDV感染最有效的免疫方式，也是区别于全身免疫的局部免疫。目前，黏膜免疫在生产实践中已被广泛应用，主要有呼吸道、胃肠道、生殖道黏膜表面的免疫，而sIgA是黏膜免疫的重要组成部分。理想的状况是，乳汁中含有充足的IgA抗体，通过哺乳来帮助仔猪抵抗病毒的感染。这与大多数疾病发生是由初乳中的IgG抗体来提供系统免疫不同。也导致它的免疫防控策略和其它疫病的有很大不同。
PEDV在侵入机体时主要通过局部抗原的有效刺激产生sIgA。最终，在猪体内，sIgA会存在于胃肠液、呼吸道分泌液、乳汁等外分泌液中、血液，参与机体免疫。在PEDV感染后的机体免疫反应中，sIgA发挥重大作用：中和粘膜上皮细胞中的病毒抗原、阻止病毒对上皮下包的黏附、溶解细菌降低毒素、稳定粘膜内环境。因而，初乳中的sIgA对于新生仔猪腹泻的防御非常重要，主要因为此阶段仔猪的免疫力非常低下（临床常见7日龄内仔猪的PEDV死亡率极高，很多猪场甚至会发生一过性的100%死亡）。
由于猪特殊的胎盘屏障结构，母猪体内具免疫力的免疫球蛋白不能通过胎盘输送给胎儿，母猪初乳中富含具免疫力的免疫球蛋白，新生仔猪只能通过初乳获得母源抗体。新生仔猪缺乏先天免疫力，其自身免疫系统一般要在出生后7-8天才开始启动。新生仔猪肠道吸收具有效时段性，在出生后数小时（36小时）内肠道处于开放状态，可吸收初乳中完整的蛋白质，尤其是以免疫球蛋白的形式存在的蛋白质可直接由肠道吸收进入机体的血液循环，36小时后肠道将关闭不再吸收完整的蛋白质进入机体的血液，而乳汁中的蛋白质仅停留于肠道的局部发挥免疫作用。初乳中的母源抗体水平在分娩后数小时下降很快。因此，在有效时段内确保新生仔猪所采食的初乳中含较高的免疫球蛋白sIgA，可有效预防新生仔猪发生腹泻。
4.2.3、PEDV传染性强
这也是为什么一旦猪场内有一头仔猪发病，其不仅会在短时间内传染给同窝的其他小猪，导致同窝仔猪的发病率高达100%，同时也会传染给同产房的其他仔猪（所谓一过性的发病）的重要原因。
4.2.4、PEDV发生变异
华中农业大学教授肖少波汇报，目前在全球存在的三类主要PEDV毒株：经典毒株（G1群)；变异毒株（G2群)(主要流行毒株, >90%)；S-INDEL毒株( 重组毒株）。当前主要流行毒株在G2群，经典毒株在G1群，而G1和G2之间是几乎没有交叉保护力的，也就是说即使免疫了G1群毒株的疫苗，其产生的抗体是不能G2群野毒的侵袭的。
4.2.5、病毒性腹泻存在混合感染
通过对各地发生病毒性腹泻猪场进行抗炎检测发现，各地PEDV的检出率均显著高于TGEV（传染性胃肠炎病毒）和PoRV（轮状病毒）；PEDV/PoRV混合检出率显著高于PEDV/TGEV和TGEV/PoRV混合感染的检出率。也就是说PED通常同PoR混合感染。
4.3、目前市场的PEDV疫苗情况表现如何？
获批上市的PEDV疫苗有以下产品：
① 猪流行性腹泻灭活疫苗（XJ-DB2株），
② 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗，③ 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗（WH-1株+AJ1102株），④ 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗（HB08株+ZJ08株），⑤ 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗（SCJY-1株+SCSZ-1株），⑥ 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗（SD/L株+LW/L株），⑦ 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联活疫苗（WH-1R株+AJ1102-R株），⑧ 猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒（G5型）三联活疫苗（弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株）。
可以发现，其中仅有一个毒株包括了目前阳性率很高的轮状病毒。
4.4、那为了防控PED，正确的思路方向应该是如何的？
从理论和实践结合看有效的思路：
疫苗：疫苗还是需要接种，尤其针对母猪群（以加强母猪自身的抗体水平和sIgA抗体水平）。但是目前的商品苗因为病毒变异导致播种效果不佳，关键还在于好用的、针对变异毒株/重组毒株、能够较好地激发黏膜免疫的商品苗尽早上市。
返饲：成年猪经口摄入高剂量的强毒能在小肠粘膜上皮细胞产生强烈粘膜免疫，刺激产生IgA。这两个因素（高剂量和经口摄入）在加强免疫时，经口摄入更加重要。一个大的合适的剂量，比多次小的剂量或者不合适的应用抗原，更能有效的刺激和加强粘膜免疫反应。
然而，收益也有对应的风险，放饲的风险在于会导致疫情反复。
生物安全。
感谢吕闯博士对本文的校订。
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| 文章来源：厚新健投 ，作者林瑾雯 文章编辑：一米优讯 |
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