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黄连等中草药组方对猪大肠杆菌
体外抑菌效果研究
李?杨 1，陈?亮 2，曾璐瑶 1，朱蓓蓓 1 *
（1.恩施职业技术学院，湖北?恩施?445000；2.泰兴市黄桥镇畜牧兽医站，江苏?泰州?225400）大肠杆菌是革兰氏阴性菌，大小0.5×1～3 μm。周生鞭毛，能运动，无芽孢。大量存在于环境中、为人和动物肠道中的常居菌，分为共生菌株和致病性菌株。宿主健康状态下一般多不致病，当菌群失衡受到致病性菌株感染或者寄主的免疫力下降则有可能会引发腹泻、胆囊炎、腹膜炎等疾病甚至死亡。由于抗生素的滥用使很多致病菌的耐药性越来越强，严重威胁人和动物的健康，加大防治难度。在解决抗生素类耐药问题中，中草药作为抗生素药物的替代药已成为研究的热点。部分中草药具有抗菌消炎、止痛止吐、补血补气等功效，并有研究证实多种中草药对多种家畜、家禽以及水产动物致病菌具有良好的抑菌效果。但对中草药组方的抗菌药物研究较少，本试验选取的黄连、黄柏、白头翁等中草药是自然界常见的植物，含有抑菌成分，且具有靶位多、广谱性、不易产生耐药性等优点。因此，本试验通过水煎法获得的中草药提取物研究其对大肠杆菌的体外抑菌效果。
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材料与方法
INTRODUCE
1.1 试验材料
大肠埃希菌标准株[CMC（B）4102]；利川黄连、白头翁、佩兰、黄柏、黄苓、藿香、苍术、银花、连翘、板蓝根、穿心莲、夏枯草、蒲公英、地丁、青蒿、秦皮、郁金、大黄、栀子、诃子、白芍，巴东一零八药材种植专业合作社。
1.2 试剂与仪器
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、LB肉汤培养基、伊红美蓝培养基，北京诺博莱德科技有限公司；95%乙醇、无水乙醇和甲醇，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司。96孔细菌培养板为美国Corning公司产品。
干燥箱，苏州巨兴烘箱设备有限公司；电子分析天平，德国Sartorius公司；电热恒温培养箱，成都瑞派斯科技有限公司；振荡培养箱，常州金坛精达仪器制造有限公司；压力蒸汽灭菌器，西安索腾医疗科技有限公司；离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
1.3 水煎法提取中草药成分
将配置好的中草药组方（表1）放进粉碎机打成粉末后称取100 g，置于烧杯中，加入5～10倍蒸馏水浸泡24～30 h，强火煮沸后改为文火煎煮30 min，用4层纱布过滤，滤液放入4℃冰箱冷藏保存；滤渣加入蒸馏水浸泡30 min，强火煮沸后改为文火煎煮30 min，4层纱布过滤，合并滤液。7 000 r/min离心5 min去除药液中残留的药粉，95℃蒸发浓缩后120℃、15 min高温高压灭菌，并用无菌水定容至100 mL，使药液浓度为1 g/mL，放入4℃冰箱中冷藏备用。
1.4 菌液的制备
将活化好的大肠杆菌划线接种于伊红美蓝培养基，置于37℃恒温培养箱中培养24 h；用接种环挑取有金属光泽的单个菌落至LB液体肉汤培养基中，37℃、转速为180 r/min的恒温摇床培养12 h，以1∶100的比例再接种于LB液体培养基，置于上述恒温摇床培养至对数期，即用全波长酶标仪检测菌液OD600约为0.6。用无菌PBS洗涤菌液后调整菌液浓度约为1×106 cfu/mL后立刻进行后续试验。
1.5 药敏纸片制备
将直径为6 mm的圆形空白药敏纸片放进药物提取液中浸泡40 min，在超净工作台中烘干备用。
1.6 抑菌试验
吸取100 μL的1.4项下所制菌液，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，室温干燥5 min。用无菌镊子夹取药敏纸片贴在平皿表面，每个平皿贴1片1.5项下制备的药敏纸片、1片含10 μg粘杆菌素、1片含10 μg多粘菌素的药敏纸片作为阳性对照、1片用无菌水处理过的纸片作为阴性对照，做3组平行试验。37℃恒温培养箱中培养24 h后用游标卡尺以不同方向测量抑菌圈直径，记录数据并取平均值。抑菌圈小于10 mm表示有轻度抑菌作用，记录为“+”；抑菌圈直径10～15 mm表示有中度抑菌作用，记录为“++”；15 mm以上表示有高度抑菌作用，记录为“+++”。
1.7 中草药的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度测定采用改良微量二倍稀释平板法测定中草药水煎剂对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定。
将96孔细菌培养板在超净台酒精灯附近无菌区打开，用移液器向第2～11孔加入100 μL高压后的蒸馏水，继续在第2孔加入100 μL制备的中草药水煎剂，混匀，取100 μL依次倍比稀释至第9孔后弃液，向第2～11孔内加入100 μL LB液体培养基，向第2～10孔加入10 μL菌液。第10孔为阳性对照孔（未加入中草药水煎剂），第11孔为阴性对照孔（未加入菌液）。将细菌培养板置于培养箱培养24 h。
培养后向每孔加入5 μL体积分数2%的四唑红（TTC），轻轻混匀，继续培养2 h后观察，以不显红色的孔内中草药水煎剂最高稀释倍数的浓度为MIC。
取50 μL细菌培养板中的培养物涂布于LB固体培养基，置于培养箱培养24 h，以无菌落生长的培养液中草药水煎剂最小浓度为MBC。
试验成立标准为阴性对照孔不变红且无菌落长出，阳性孔变红且有菌落长出。重复试验3次。
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结果与分析
INTRODUCE
2.1 中药提取物对大肠杆菌的抑制效果
表2展示了中草药的水煎剂对大肠杆菌的抑制效果3种组方中，黄连组方2水煎剂对大肠杆菌的抑菌圈直径最大，表现为极敏，且黄连组方2的抑菌效果与抗生素多粘菌素差异不大，比粘杆菌素的抑菌作用强；黄连组方3表现为高敏；黄连组方1为中敏。
2.2 中草药的MIC和MBC
MIC和MBC测定试验结果见表2。由表2可见，黄连组方2水煎剂MIC数值最低，为18.65 mg/mL，黄连组方1和组方3水煎剂MIC 62.5 mg/mL和33.52 mg/mL，3种组方草药对大肠杆菌均表现出抑菌效果。黄连组方2的MBC数值最低，为18.65 mg/mL，黄连组方3水煎剂MBC为62.18 mg/mL，黄连组方1中草药组方对试验菌株的抑菌效果最不明显，MBC为125 mg/mL。
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结论与讨论
INTRODUCE
为研究黄连、白头翁、黄柏等中草药组方水煎剂作为临床治疗肠外致病性大肠杆菌病可行性，以黄连为主，对21种中草药组成的组方的体外抑菌效果进行了检测。结果显示，大肠杆菌对3种黄连组方表现出不同程度的敏感性，中草药水煎剂抑菌效果从高到低依次为黄连组方2、黄连组方3、黄连组方1，其中黄连组方2的抑菌效果最强，与多粘菌素相差不大，高于粘杆菌素。
本研究结果显示，复方中草药的整体抑菌效果较单方更好。黄连组方2和黄连组方3的抑菌圈直径均大于1 500 mm，抑菌等级为高度抑菌；部分组方抑菌圈较黄连、诃子单一作用时小，这可能与多种中草药联用时发生物理、化学反应或作用位点竞争导致的抑菌活性成分损失或扩散速率下降有关，也可能与单方中草药的单位体积有效成分多于在组方中的含量，混合后抑菌成分含量减少存在联系。复方中草药MIC/MBC试验结果提示，合理的配伍可提高中草药对大肠杆菌的体外抑菌作用，这对降低药物成本、减少药物使用及残留具有重要作用。综合整体抑菌结果，黄连组方2（利川黄连、白头翁、黄柏、秦皮）可作为猪大肠杆菌抑菌药物的首选配伍组合，但抑菌作用机制及组分协作方式亟待进一步研究。
本研究以简便的煎煮法制备21种中草药水提取液并配制复方，初步研究它们对猪大肠杆菌的抑菌性质。然而，生产中中草药常以饲料添加剂、浸泡后播撒或成品兽药等形式使用，提取与使用方式的不同是否会对其抑菌能力产生显著影响尚不清楚，故中草药开发为临床兽药还需结合中草药的特性及适宜制备工艺多加验证。
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