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热应激对鸡肠道屏障的影响及损伤机制研究进展
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2024/3/15 7:49:12 关注：167 评论： 我要投稿
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摘 要：
热应激通过上调皮质醇激素，升高血清内毒素含量，上调肠道内炎症、氧化、凋亡水平增加肠道通透性，最终引发机体系统性炎症反应综合征（SIRS）、多器官功能障碍（MODS），给养殖业造成损失。近年来全球温度持续上升，热应激造成的畜牧业损失引起广泛关注。本文总结了热应激影响鸡生产性能、肠道形态结构、肠道屏障功能（包括炎症反应、氧化应激、凋亡水平）的相关研究及机制，旨在为防治家禽高温应激提供理论参考。
1 热应激对肉鸡生产性能的影响
热应激条件下，家禽体内多种自身平衡被打破，激活下丘脑 - 垂体 - 肾上腺皮质轴（HPA），肾上腺皮质激素分泌增加，采食量降低，影响了家禽生长性能，促进家禽小肠肠道形态结构的损伤。赵燕春等研究发现热应激条件下家禽表现为甲状腺分泌功能出现紊乱且与临床特征一致。李秋粉用 21 日龄 AA 肉仔鸡在28℃ -35℃ -28℃进行 8 h 日循环热应激实验，发现热应激 7 d 和 21 d 显著降低肉鸡的平均日采食量和平均日增重，提高耗料增重比。Ruff 等在对 21 日龄肉鸡 7、14、21 d 慢性热应激（35℃）实验中同样有上述发现。且Baxter Mikayla等研究表明，热应激对机体生产性能造成的影响与体内循环皮质酮（CORT）表达水平显著上调密切相关。
热应激分为急性热应激和慢性热应激。环境温度在数小时内急剧上升通常导致急性热应激，慢性热应激是指机体在环境温度长时间（d≥3）持续高温条件下产生的非特异性防御反应，慢性热应激和急性热应激对机体造成的影响不尽相同。Alhanof 等用 26 日龄肉鸡经过慢性（30±2℃，24 h/d）和急性热应激（35±2℃， 4 h/d，其余时间为 20±2℃）实验，发现 2 组肉鸡的体重和体增重均显著降低，但与慢性热应激不同的是，急性热应激组的死亡率显著增加。Sarsour 等研究也得出相同的结果。由此可见，肉鸡在 35℃以下的慢性热应激可导致生产性能下降，但在 35℃急性热应激条件下的肉鸡可发生死亡。通过上述的研究可以推测，短时间的高温环境比长时间的高温对家禽和养殖业的影响大，慢性热应激对机体生产性能的影响随时间的延长而增大。
2 热应激对鸡肠道形态结构的影响
小肠是食物消化和吸收的主要场所，对机体维持健康有重要意义。已有大量研究证明，热应激能降低肉鸡的饲料转化率的因素，除了与激活 HPA 轴相关之外，还与肠道形态结构的完整性密不可分。Lan等研究表明35日龄中华黄羽肉鸡经过（34℃，10:00—18: 00， 8 h，其余时间为 24℃）热应激后，显著降低十二指肠和空肠的相对重量，降低十二指肠、空肠和回肠的绒毛 高度（V），降低回肠绒毛高度 / 隐窝深度（V/C）。但与急性热应激结果不同的是，潘子意对56日龄肉鸡为期4周的慢性热应激条件下（32.5±1.4℃），小肠绒毛高度、隐窝深度、肠绒毛面积无显著变化。由上述可得，热应激对肠道形态结构的影响与鸡只日龄密切相关，且不能排除 32℃经急性热应激对肠道造成的损伤后，经长时间（d≥3）热应激鸡体出现肠道自愈的现象。但与上述结果不同的是，龙光莲用21日龄肉鸡以 28℃ -36℃ -28℃日循环温度变化的热应激（8 h） 研究中，发现热应激 1 d 后的小肠绒毛高度、隐窝深度及 V/C 值与对照组无显著差异，而热应激 14 d 后，肉鸡小肠黏膜形态结构遭受极显著破坏，王晓亮研究也表明 36℃急性热应激显著降低 36 日龄肉鸡空肠 V/C 值， 且 Shah 等对鸡 36℃日循环慢性热应激的研究中，同样表明各种肠段绒毛高度、绒毛表面积与V/C值降低。李秋粉研究同样也表明，对21日龄肉鸡 35℃急性和慢性热应激均可降低十二指肠 V/C值。因此可以总结出，21日龄左右的肉鸡较56日龄肉鸡对热应激更敏感，且 35℃的高温环境是决定肉鸡肠道损伤与否的关键临界温度。
3 热应激对鸡肠道屏障功能的影响
紧密连接主要由 Occludin、ZO-1、Claudin（至少24 个成员）、Junctional Adhesion Molecule（JAM）和 Tricellulin 4 种跨膜蛋白构成，其中 Occludin、Claudin 是紧密连接主要作用蛋白。Claudins 据功能不同可分为两大类：一类是参与屏障形成（降低细胞旁渗透性）的 Claudins；另一类是在通道孔中起作用的 Claudins（增加细胞旁渗透性）。在肠道内 Claudin-1、-3、-4、-5、 -8、-9、-11、-14 可归类为形成屏障的 Claudins， 而 Claudin-2、-7、-12、-15 是形成孔隙的 Claudins。其中支架蛋白（PALS1）和其相关紧密连接蛋白（PATJ） 的表达也参与调节肠道屏障紧密连接的细胞旁通透性。大量研究表明，热应激可以通过损伤肠道紧密连接、降低肠道抗炎水平、增加肠道氧化应激、上皮细胞凋亡增加对肠道屏障的损伤。
3.1 热应激对鸡肠道屏障紧密连接结构的影响
有报道称热应激损伤肠道屏障紧密连接结构的完整性。热应激可以直接影响紧密连接相关蛋白的表达，增加紧密连接的通透性，迄今为止已被大量研究证实。Tabler Travis 等研究表明，热应激（36℃，2 h）下调肉鸡空肠中 PALS1 和 PATJ 的表达，显著下调回肠中 Occludin 和间隙连接蛋白 α1（GJA1）的表达。热应激（33±2）℃第 7 天，雏鸡回肠组织中 Occludin、 Claudin-1、ZO-1 蛋白的表达水平显著降低 ，最终随着紧密连接蛋白的破坏而增加肠道通透性。除了相关紧密连接蛋白的表达下调之外，35℃热应激还显著提高了热应激第 7 天肉鸡血清 D-乳酸含量和 21 d 血清内毒素含量。35℃慢性热应激 7、14、21 d 后鸡血清 FITC-d 含量提高，且随热应激时间的延长而升高。
热应激可以通过激活肌球蛋白轻链激酶（MLCK）， 诱导肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化，导致肌动球蛋白环（PAMR）收缩，打开细胞旁通路，增加肠道通透性。Uerlings 等研究表明，热应激（39℃，72 h）显著增加 MLCK mRNA 水平。
热应激对不同肠段有不同的影响。与回肠和空肠不同的是，热应激（36℃，2 h）显著上调了肉鸡十二指肠中 ZO-1、ZO-2、脂质运载蛋白（LCN2）、绒毛蛋白 1（VIL1）和钙卫蛋白（CALPR）的表达。32℃慢性热应激与急性热应激对十二指肠紧密连接影响一致，均显著上调鸡十二指肠 Occludin 和 ZO-1的 mRNA 基因表达，下调空肠和回肠黏膜中 Occludin、ZO-1的 mRNA 基因表达。
由上述可知，热应激可以调控肠道紧密连接蛋白的表达，如热应激下调肉鸡空肠中 PALS1 和 PATJ 的表达和下调回肠中 GTA1 的表达；可以通过激活 MLCK 增加肠道通透性，并且这些影响随着热应激时间的增长而加重。据各肠段的不同，热应激造成的影响也不同，热应激对十二指肠黏膜蛋白表达的影响与对空肠和回肠的影响不一致，如 Occludin 和 ZO-1 的 mRNA 基因表达。
3.2 促炎因子水平
热应激可以通过炎症因子激活 MLCK，增加肠道通透性。干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子 （TNF-α）、TNF-α /IFN-γ、LIGHT/IFN-γ、IL-1β、 IL-4、IL-6、IL-13 促炎因子增多均能增加肠道通透性，其中TNF-α/IFN-γ、LIGHT/IFN-γ、IL-1β 表达都是上调 MLCK pMLC 的结果。已知 TNF-α 诱导的 TEER 下降与 MLCK 表达和 MLC 磷酸化密切相关，并被 MLCK 抑制剂抑制，另有一种机制也被发现，即在肠道 HT29/B6 细胞中，TNF-α 通过增加 Claudin-2 的表达降低 TEER，且该过程由磷脂酰肌醇-3 激酶（PI3K/ Akt）调控。另外这 2 种因子不仅可以独立损伤肠道屏障，也可以协同作用但需要 MLCK 的激活和紧密连接蛋白的内化作用。
热应激还可以通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径激活炎症反应，增加肠道通透性。MAPK级联是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，是多重压力下调节网络的核心。热应激通过促 MAPK 信号通路诱使肠道细胞骨架重组，通过激活 NF-κB 通路诱发炎症反应，使它们共同导致肠道损伤。Yu 等研究表明 MAP 和 MAPK 蛋白质可能通过调节细胞凋亡和蛋白酶体相关途径参与对冷应激的反应。马艳玲等研究表明，HOG-MAPK 途径可以响应热应激，参与调控黄曲霉、赭曲霉等致病真菌的生长。热休克蛋白 27（Hsp27）和 热休克蛋白 70（Hsp70）属于低分子量热休克蛋白家族的成员，研究报道 p38 MAPK2 通过磷酸化 Hsp27 介导细胞骨架重建；在慢性热应激导致鸡大脑、心脏、 和腿肌组织损伤和炎症反应的研究中发现，热应激后期 （4~6 h）Hsp70 对 NF-κB 的抑制作用是引起先天免疫反应减弱的重要因素，并且该过程与 MAPK 信号通路有关。
热应激主要通过激活 DAMPs-TLRs-MAPKs 介导的信号通路，影响炎症因子表达水平，损伤肠道屏障的完整性。高迁移率族蛋白 B1（HMGB1）是促炎后期产生的关键蛋白，能够衡量炎症水平。热应激（36℃， 8 h） 1 d 和 14 d 显著提高十二指肠HMGB1 的 mRNA 表达量。龙光莲研究中还表明急性热应激可显著提高十二指肠 TLR2、TLR4、IRAK-4 的 mRNA 表达量；慢性热应激显著提高十二指肠 TLR2、TLR4、TLR5、MyD88、TRIF 的 mRNA 表达量。另有研究报道，IL-10 是一种重要的抗炎细胞因子，IL-10 的过表达有利于调节肠道稳态并防御炎症性肠病（IBD）。李秋粉研究表明，热应激（35℃，21 d）显著提高肉鸡血清肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）、 白细胞介素 -6（IL-6），降低IL-10 含量。Wang 等研究表明，热应激（33±2）℃ 显著升高血清和回肠中 SIgA、IL-6 含量，显著降低血清内 IL-10 含量，但回肠内 IL-10 含量有增高趋势，说明各肠段对热应激反应有不同的耐受性。另 Alhanof 等研究也证明了热应激可以从机体全身炎症水平损伤肠道屏障，如急性和慢性热应激可以显著升高 26 日龄肉鸡内毒素脂多糖和全身炎性细胞因子 TNF-α 和 IL-2 的血清浓度，显著增加 Hsp70、IL-18、TNF-α、C反应蛋白的表达水平和空肠中血清 FITC-d 水平以及空肠中 Hsp70 和 IL-18 的表达。
由以上可知，热应激可以通过 MAPK 通路参与炎症反应进而损伤肠道屏障，也可通过热休克蛋白和 NF-κB调控 MAPK 通路，影响炎症因子和肠道紧密连接蛋白的表达。然而热应激最主要的作用机制是：热应激激活 DAMPs-TLRs-MAPKs介导的信号通路，促进促炎细胞因子表达，降低抗炎细胞因子和 TLRs 信号通路调控因子表达，且被大量研究证实。
3.3 氧化应激水平
热应激造成肠道上皮细胞氧化应激损伤紧密连接，增加肠道通透性。Lu 等研究表明，热应激导致机体发生氧化应激与线粒体发生不可逆损伤密切相关。Nrf2 是氧化应激反应过程中重要的转录因子，机体发生氧化应激，Nrf2 从调控蛋白（Keap-1）中分离，随后转位到细胞核与抗氧化反应原件（ARE） 结合，增加抗氧化蛋白的表达，在机体缺氧条件下，ROS 异常积聚，通过 Nrf2 过度激活氧化应激反应，损伤线粒体，降低免疫力，影响细胞正常代谢功能。信息调节因子 1（SIRT1）是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性脱乙酰酶，能够参与基因转录、能量平衡和氧化应激等多种生理功能的调控，处于各种代谢信号通路的枢纽位置。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP）活化蛋白激酶 （AMPK）是调节生物能量代谢和氧化应激过程中的重要分子。缺氧诱导因子（HIF）是转录因子，能对细胞环境中可用氧的变化做出反应，当ROS 含量较高时，半胱氨酸残基被继续氧化，抑制 HIF-1α 活性，与此同时，ROS 水平持续升高，激活 SIRT1-AMPK-PGC1α 信号轴，使细胞从线粒体呼吸和主动修复反应转向糖酵解代谢，造成线粒体机能不可逆受损，发生氧化应激。
热应激造成细胞氧化应激反应已被大量研究证明，最早 Lambert 等在 2002 年发现高温诱导的肠道通透性升高与氧化应激之间有密切联系，并利用抗氧化酶降低肠道通透性达到保护效果，这一发现确定了热应激可以造成氧化应激损伤，并对肠道有一定的影响。近些年来针对热应激对机体造成机体氧化应激的机制一直被论证，有研究表明，热应激显著增加血清中和肝脏中 Hsp70 含量，降低血清和肝脏中 Nrf2 含量，显著增加血清中和肝脏中 Keap-1 含量。Sarsour 等在研究急性热应激和慢性热应激对肉鸡的影响中，发现热应激显著降低肝脏中还原型谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比率。此外，热应激还可以显著降低肉鸡空肠和回肠黏膜中 T-AOC 和硒半胱氨酸（GSH-Px） 的活性和小肠黏膜抗氧化能力（T-AOC、GSH-PX、 CAT、SOD），显著提高十二指肠和回肠黏膜的 MDA 含量，证明热应激对机体存在氧化还原的影响。另有研究表明，各肠段对热应激做出的反应也不尽相同，如 32℃高温环境 28 d 慢性热应激后，小肠内 CAT 显著降低和 MDA 表达量显著升高，十二指肠中T-AOC 变化不显著，但其在空肠和回肠中表达量显著降低，十二指肠和空肠中 GSH-Px 的表达量显著降低，回肠中变化不显著；十二指肠和回肠中 T-SOD 变化不显著，而空肠中显著降低。
由上述可知，热应激通过抑制线粒体呼吸复合物 （I、III、IV）活性和 ROS 的蓄积使机体发生氧化应激，Nrf2、SIRT 1、AMPK是该过程发生的关键因子；热应激可显著降低肠道黏膜抗氧化水平，增加肠道屏障损伤。
3.4 细胞凋亡水平
高温引起细胞凋亡的发生，p38MAPK 通路是调节细胞凋亡的主要作用机制。细胞凋亡受促凋亡信号通路和抗凋亡信号通路双重调控。细胞促凋亡信号通路分内源性和外源性，内源性由线粒体介导，细胞色素C氧化酶基因（COI）是该信号通路关键基 因；外源性由死亡受体介导，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导因子配体（TRAIL）是该信号通路关键基因，另应激活化蛋白激酶基因（SAPK）是细胞促凋亡信号通路的上游基因，这 3 个基因的高表达都可以促进细胞凋亡。与凋亡相关的因子主要有促凋亡蛋白家族代表基因（BAX）、抗凋亡蛋白代表基因（BCL2）和半胱 氨酸 - 天冬氨酸蛋白酶（Caspase）。另有研究表明热应激通过转录依赖的线粒体 p53 路径引起广泛的内皮细胞凋亡，通过 NF-κB 参与细胞生长、凋亡，依赖于一系列被称为 Caspase 的激活，导致细胞凋亡， 也有研究表明，细胞凋亡与氧化应激密切相关，它可以通过机体氧化应激的反应，诱导线粒体损伤，最终 导致细胞凋亡。由此可见，引起细胞凋亡是多方面作用的结果。李樊等研究表明，热应激使绵羊卵巢线粒体分裂蛋白（FIS1）表达量显著上升，BAX/BCL2 mRNA 表达量显著上升，增加细胞凋亡率。对 60 日龄麻鸭 39℃热应激 60 min 显著增加肝细胞凋亡数，促进 Bax、Caspase-3、Bax/Bcl-2 mRNA 核蛋白的表达。有研究报道，热休克蛋白 60（Hsp60）和热休克蛋白 70（Hsp70）均有促细胞凋亡作用，且血清中 Hsp60 含量被认为是疾病发展的潜在生物标记之一。Hsp70 可以介入细胞凋亡信号转导通路，调节凋亡相关基因的表达，最终直接参与细胞凋亡过程。热应激还可促进 Hsp70进入H9C2 心肌细胞核，然而到热应激后期 （d≥4 h）Hsp70 表达受抑制，Hsp70 蛋白入核显著降低， 促进细胞凋亡 。
综上所述，热应激可致肠道上皮细胞凋亡，主要由 p38、p53 路径，通过 NF-κB 参与细胞凋亡，损伤肠道紧密连接，增加肠道通透性，且 Hsp70 和 Hsp60 是不可缺少的关键因子。热应激损伤鸡肠道屏障途径汇总见图 1。
4 总结与展望
本文总结了 35℃高温环境造成鸡肠道屏障受损严重，死亡率增加，低于该温度时，急性热应激对鸡肠道造成一定的损伤，慢性热应激时也有一定的损伤，但后期有恢复的迹象。热应激对各肠段紧密连接蛋白的影响也不尽相同，热应激上调十二指肠中 Occludin 和 Zo-1 的 mRNA 基因表达，而回肠和空肠段相应蛋白的表达趋势与之相反。作用机制方面，热应激激活 HPA 轴影响肉鸡采食量和甲状腺激素代谢平衡，降低鸡生产性能，损伤小肠绒毛结构并降低鸡饲料转化效率，下调小肠中紧密连接蛋白（PATJ、OCLN、GJA1）的表达损伤肠道屏障完整性，激活 MLCK 增加肠道通透性，激活 DAMPs-TLRs-MAPKs 介导的信号通路，调控炎症因子表达，损伤肠道紧密连接；氧化应激水平上，热应激增加 ROS的蓄积促发机体氧化应激，增加肠道通透性；凋亡水平上，热应激通过 p38MAPK、p53 路径引发肠道细胞发生凋亡，且 Hsp60、Hsp70 具有一定的促凋亡作用。综上所述，热应激造成肠道屏障损伤的过程与抗炎、氧化和凋亡的途径中有共同反应通路，主要表现在损伤肠道紧密连接结构、肠道炎症反应和凋亡水平之中。
就目前研究现状分析，已有大量研究证明热应激引起鸡肠道受损，影响鸡生产性能。针对这一现状，大量抗热应激药物和饲料添加剂已被研究（如锦灯笼提取物、 丁酸钠、硫氨基酸、藻类多糖等），但多数研究限于证明药物可以通过下调鸡的炎症、氧化、凋亡水平缓解热应激对鸡的损伤，而关于这些药物主要通过什么途径、作用哪一靶点鲜有文献发表，有关突破药物靶点的研究 将为兽药和畜牧业领域提供广大发展前景。
作者简介：周慧爽（1999-），女，山东济宁人，硕士研究生，主要从事药理学与毒理学研究，E-mail：1870612137@qq.com*通讯作者：殷斌（1988-），女，山东聊城人，博士，助理研究员，从事新兽药研，E-mail：yb53650@163.com；万仁忠（1967-），男，山东菏泽人，博士，教授，从事药理学与毒理学研究，E-mail：wrzh63@163.com
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