摘要:为了解广西中越边境地区蜱的种类分布及其非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)携带情况,采用布旗法捕捉游离蜱,直接法采集动物体表的寄生蜱,进行分类鉴定,同时采用荧光PCR方法检测ASFV核酸。结果显示:共捕获222只蜱,经鉴定属于2科5属8种,包括7种硬蜱、1种软蜱(蝙蝠锐缘蜱);优势种为微小牛蜱和粒形硬蜱,没有捕捉到与传播ASFV相关的钝缘蜱;所有捕获的蜱未检测出ASFV核酸。结果表明,广西中越边境地区以硬蜱分布为主,蜱携带传播ASFV的风险较低,但鉴于该地区的疫情形势、家猪养殖模式以及野猪分布,蜱在ASFV传播和储存方面仍存在潜在风险。今后,需要进一步扩大蜱捕捉区域,深入开展蜱种类分布调查及其ASFV携带情况监测。
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的猪烈性传染病。该病2018年8月首次发现于我国辽宁省,随后疫情从东北地区迅速蔓延至全国各地,对我国养猪业造成了不可估量的经济损失。2019年2月20日,越南向世界动物卫生组织(OIE)首次报告发生ASF疫情,其后疫情席卷越南全境。与越南毗邻的我国广西也于2019年2月发生了首例ASF疫情。蜱在ASFV传播过程中扮演着重要角色。ASFV 可在钝缘蜱属(Ornithodoros)的软蜱体内复制,从而使蜱成为病毒的储存库,经叮咬可引起猪感染。据刘建等推测,软蜱最适生长温度为22~30 ℃,最适湿度为75%~95%。广西属亚热带季风气候区,全年平均气温为16.5~23.1 ℃,雨水丰沛,季节变化不明显,很适合蜱繁殖。目前关于广西蜱种类的报道始见于廖国厚等的硬蜱调查,但至今未见关于软蜱的报道。鉴于ASFV可在蜱体内长期存在,而且可在野猪-蜱-家猪三者间循环传播,因而不能忽视蜱传播ASFV的潜在风险,尤其是广西。为了解广西中越边境地区蜱的种类分布及其ASFV携带情况,开展了此次流行病学调查,以期为广西中越边境地区ASF防控决策提供依据。
材料与方法
蜱捕捉地点及时间
广西地处南疆边陲,有8个市(县)与越南毗邻,山水相连,没有天然屏障。边境线长1 026 km,有194条通道可通行机动车辆。本次蜱采集区域主要靠近中越边境线,包括东兴市马路镇、东兴镇、峒中镇,宁明县爱店镇、桐棉镇,龙州县水口镇、武德乡,凭祥市友谊镇、凭祥镇、上石镇,靖西市龙邦镇、宁安乡,那坡县平孟镇。捕捉时间为2019年6月—2020年11月。
蜱采集方法
游离蜱 采用布旗法,用90 cm×60 cm的白布旗,在调查区域内定时拖蜱。手持旗杆伸向一侧,使旗子平铺于草丛上,等速缓步前行,每步行10 m停下观察1次,将附于旗上的蜱捡入容器内,带回实验室统计捡获蜱总数,同时进行蜱分类鉴定和ASFV核酸检测。
寄生蜱 采集鼠、狗、牛、羊、蝙蝠等动物体表寄生蜱于容器内,带回实验室统计捡获蜱总数,以及蜱分类鉴定和ASFV核酸检测。
蜱分类鉴定
按《中国国境口岸病媒生物及动物虫媒病》和《中国国境口岸医学媒生物鉴定图谱》进行。
ASFV核酸检测
ASFV核酸检测,比如样品处理、核酸提取等,严格按照《实验室生物安全通用要求》(GB 19489—2008)执行。
蜱处理 将整只蜱置于组织匀浆器中充分研磨,加入1 000 IU/mL的青霉素、1 000 ?g/mL的链霉素、0.1 mol/L的灭菌PBS(pH7.4),制备10%组织匀浆液,2 000 r/min离心处理10 min,取上清液,标记编号,立即进行ASFV检测或冷冻储存备用。
引物和探针 针对ASFV B646L基因保守序列设计引物和探针。上游引物VP72-F1:5'-GCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCT-3';下游引物VP72-R1:5'-CCGTAGTGGAAGGGTATG-TAAGAG-3':TaqMan探针VP72-T1:FAM-CCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCG-BHQ1。
核酸扩增 按试剂盒说明书进行。扩增条件:50 ℃孵育2 min;95 ℃预变性3 min;预扩增,95 ℃变性5 s,55 ℃退火延伸30 s,5个循环;扩增,95 ℃变性5 s,55 ℃退火延伸30 s,40个循环。荧光通道选择FAM,在扩增阶段每个循环的55 ℃时收集荧光信号。设置扩增体系为25 ?L,同时选择passive reference 和quencher为none模式。
结果判定 (1)基线和阈值设定。基线调整取6~15个循环的荧光信号,阈值设定以阈值线刚好过阴性对照检测荧光曲线的高点为原则。(2)质量控制。阴性对照应无特定扩增曲线,且Ct>38.0或无;阳性对照Ct≤30.0,且扩增曲线明显;否则试验视为无效。(3)样品判定。待检样品荧光信号有指数型增加,且Ct<35.0,为阳性;未检测到Ct或Ct>38.0或无明显扩增曲线,则为阴性;35.0≤Ct≤38.0时,复检1次,复检结果为阳性则判定为阳性,否则为阴性。
结果
蜱分类鉴定
共捕捉蜱222只,经分类鉴定属于2科5属8种;区域分布广泛,优势种为微小牛蜱和粒形硬蜱。222只蜱中,有7种硬蜱,只有1种软蜱且只在蝙蝠身上捕捉到(表1)。部分蜱种鉴定照片见图1。
ASFV核酸检测
所有的222只蜱,经荧光PCR方法检测,均为ASFV核酸阴性(图2)。
讨论
ASF是由虫媒双链DNA的ASFV引起猪高死亡率的病毒性疫病,自2018年8月传入我国以来,给我国养猪业造成了严重经济损失。我国对防控ASF十分重视,出台了多条政策,实施各种措施提高ASF防控能力,控制ASF的肆意传播,取得了阶段性效果。到2020年底,我国生猪产能已恢复到2017年底的90%以上。由于目前尚未有ASFV疫苗,因此防控ASF形势仍然严峻。
据报道,ASFV可在蜱体内持续存活几个月到5年。软蜱科中的钝缘蜱属(Ornithodoros)是ASFV极为重要的自然宿主和储存宿主。此类蜱叮咬了被ASFV感染的猪时便会携带此病毒,当其再次吸血时就会导致该病传播。历史上,在ASF传播中,钝缘蜱担当了重要角色。比如,20世纪60年代,西班牙和葡萄牙的ASF疫情流行中,软蜱充当了重要的媒介和储存宿主作用。软蜱寿命很长,有资料介绍可生存20年,大多数ASFV野毒株可在软蜱体内持续存活,可长达8年甚至终生。一旦ASFV侵入蜱的生存循环圈,将对家猪带来长期威胁,难以根除。1957年ASF传入葡萄牙,直到1993 年底才被净化,历时36年。1999年11月,葡萄牙南部Alentejo省一农场复发ASF疫情。调查发现,疫情发生是因猪舍内游走的钝缘蜱,而这距离最后一次疫情将近6年时间。经对葡萄牙暴发的ASF疫情进行调查,发现扑灭疫情后2.50~5.25年仍有8.8%的猪场存在感染ASFV的蜱。
广西蜱种类繁多,据报道,已发现6属11种:爪哇花蜱(Am. javanense)、巴氏盲花蜱(Ap. barbouri)、厚体盲花蜱(Ap. crassipes)、微小牛蜱(B. microplus)、缅甸血蜱(H. birmaniae)、具角血蜱(H. cornigera)、嗜鸟血蜱(H. ornithophila)、粒形硬蜱(I. granulatus)、卵形硬蜱(I. ovalus)、镰形扇头蜱(R. haemaphysaloides)、短小扇头蜱(R. pumilio)。此次调查于蝙蝠上捕捉到了蝙蝠锐缘蜱,表明广西中越边境地区有软蜱分布,但没有捕捉到传播ASFV风险较高的钝缘蜱。今后要扩大蜱的捕捉区域,争取捕到更多的属种,以确定广西蜱的种类分布。本次调查捕捉到的蝙蝠锐缘蜱的ASFV传播作用,有待今后进一步研究。
本次调查未在捕捉到的蜱中检测到ASFV,但广西和越南家猪中存在ASF疫情,且中越边境线上有一些散养的野猪与家猪杂交品种。这些杂交品种猪都是放养的,是实际意义上的丛林猪,和野猪生境差不多,因此存在病毒进入此循环圈的风险,今后需要继续加强对这些猪群及蜱的ASFV监测。
结论
调查发现,广西中越边境地区以硬蜱分布为主,但也存在软蜱;虽然未在捕获的蜱中检出ASFV,但鉴于该地区疫情形势、家猪养殖模式以及野猪分布,蜱在ASFV传播和储存方面的潜在风险依然存在。因此,需要进一步扩大区域,继续开展蜱的调查及其ASFV携带情况监测。
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