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动物源性食品中细菌的检测——肉毒梭菌
现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2021/7/4 18:59:16 关注：1010 评论： 我要投稿
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肉毒梭菌（Clostridiumbotulinum）是一种生长在缺氧环境下的细菌，在罐头食品及密封腌渍食物中具有极强的生存能力，是目前毒性最强的毒素之一。肉毒梭菌是一种致病菌，在繁殖过程中分泌毒素，这种毒素是毒性最强的蛋白质之一。军队常常将其用于生化武器。人们食入和吸收这种毒素后，神经系统将遭到破坏，出现头晕、呼吸困难、运动神经麻痹和肌肉乏力等症状。该菌为腐物寄生菌，在自然界中分布广泛，在土壤、海洋或湖泊的沉积物，动物的肠道中常可检出，偶亦存在于动物粪便中。检验食品特别是不经加热处理而直接食用的食品中有无肉毒毒素或肉毒梭菌（例如罐头等密封性保存的食品）至关重要。
1 病原学特征
1.1 形态和染色特性
肉毒梭菌属厌氧性梭状芽孢杆菌属，为（0.3～1.2）μm×（3～20）μm的大杆菌，不同代谢群菌株的大小有差异，单独或成双排列，有时可见短链状。新鲜培养基的革兰氏染色为阳性。具有该菌的基本特性，即厌氧性的杆状菌，为多形态细菌，两侧平行，两端钝圆，直杆状或稍弯曲。肉毒梭菌具有4～8根周毛性鞭毛，运动迟缓，无荚膜。有芽孢，芽孢比繁殖体宽，呈梭状，芽孢椭圆形，大于菌体，位于次极端，使菌体似网球拍状，或偶有位于中央，常见很多游离芽孢。当菌体开始形成芽孢时，常常伴随着自溶现象，可见到阴影形。
1.2 培养和生化特性
肉毒梭菌专性厌氧，对温度的要求因菌类不同而异。一般最适生长温度为30～37℃，多数菌株在25℃和45℃也可生长。产毒素的最适温度为25～30℃。培养基的最适pH为6.0～8.2，pH8.5可抑制其生长。该菌对营养要求不高，在普通培养基中均能生长。肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同性，也常见到株间的差异。
在固体培养基表面上，形成不正圆形、1～6mm的菌落，扁平或稍隆起。菌落透明或半透明，表面呈颗粒状，边缘不整齐，界线不明显，向外扩散，呈绒毛网状，常常扩散成菌苔。在血平板上，出现与菌落几乎等大或者较大的溶血环。在乳糖卵黄牛奶平板上，菌落下培养基呈乳浊状态，菌落表面及周围形成彩虹薄层，不分解乳糖；分解蛋白的菌株，菌落周围出现透明环。能消化肉渣，使之变黑，有腐败恶臭。液化明胶。产生硫化氢，不形成吲哚。
1.3 抵抗力
该菌繁殖体抵抗力中等，80℃经30min或100℃经10min能将其杀死，但肉毒梭菌芽孢的抵抗力极强，在动物尸体、骨头、腐烂植物、青贮饲料和发霉的青干草中能存活6个月以上，能耐受煮沸达5h，10%的盐酸能于1h内、20%的甲醛能于24h内将其杀灭。
肉毒毒素对酸及消化酶都有很强的抵抗力，在pH为3.6～8.5时不被削弱。在动物尸体、骨头、腐烂植物、青贮饲料和发霉的青干草中毒素能保持数个月，但80℃经30min能使之变性，0.1%高锰酸钾也能破坏其毒性。
1.4 抗原性
根据所产生毒素的抗原性不同，肉毒梭菌分为A、B、C、D、E、F、G这7个型，其中C型又分为Cα、Cβ。能引起人类疾病的有A、B、E、F型，其中以A、B型最为常见。
2 流行病学特征
肉毒梭菌芽孢广泛存在于自然界中，土壤为其自然居留场所，动物胃肠道内容物、粪便、腐败尸体、腐烂饲料及各种植物中都含有。这些芽孢在适宜的条件下能繁殖产生外毒素。A、B、E、F型毒素是人肉毒梭菌中毒的最普遍原因，C型和少数D型只引起人以外动物的肉毒中毒。B型主要见于欧洲和北美洲东部，A型主要见于北美洲西部，E型主要见于欧洲中部、俄罗斯、日本和加拿大。肉毒梭菌在自然界的分布上具有某种区域性差异，显示出生态上的差别倾向。A、B型的分布最广，其芽孢广泛分布于自然界中，各大洲的许多国家均有检出；C、D型的芽孢一般多存在于动物的尸体中，或在腐尸附近的土壤中；E型菌及其芽孢存在于海洋的沉积物、水产品的肠道内，E型菌及其芽孢适应于深水的低温，使E型菌在海洋地区的分布广泛。但是越来越多的调查结果表明，除G型菌之外，其他各型菌的分布都是相当广泛的。
肉毒梭菌中毒在畜禽中的发生与饲料保存和处理、放牧地的卫生条件有密切关系。在畜禽中以鸭、鸡、牛、马较为多见，绵羊及山羊次之，猪、犬及猫少见。易感畜禽为单蹄动物、家禽、大小反刍动物及猪。貂也有很高的易感性。自然发病主要是由于采食腐败尸体、腐败饲料所引起。
人的肉毒梭菌中毒发生并不多，但是发病急、病程发展快、病死率高。肉毒中毒是毒素中毒，潜伏期较短，一般为6～36h，最长60h。主要症状有：视力减弱、全身无力、伸舌和张口困难、抬头费力、瞳孔散大、呼吸麻痹等。
肉毒梭菌中毒一年四季均可发生，发病主要与饮食习惯有着密切关系。引起人类中毒的食品有腊肠、火腿、鱼和鱼制品及罐头食品等。在美国以罐头食品中毒较多，日本以鱼制品较多，在我国主要与发酵食品有关，如臭豆腐、豆瓣酱、面酱、豆豉等。其他引起中毒的食品还有熏制未去内脏的鱼、填馅茄子、油浸大蒜、烤土豆、炒洋葱、蜂蜜制品等。
3 危害
肉毒梭菌是严重的食源性致病菌，是致死性最高的病原体之一。肉毒梭菌感染剂量极低，每个人都易感。摄食18～36h后发病为典型病症，但不典型的可在4h至8d不等。症状为虚弱、眩晕、复视、渐进性说话障碍、呼吸和吞咽困难，也会出现腹胀和便秘。
肉毒毒素是一类锌结合蛋白，具有蛋白酶活性，性质稳定，毒性极强，是最强的神经麻痹毒素之一，也能损害血管细胞和其他组织。当摄入的毒素经胃肠吸收进入血液后，即对外周神经系统和自主神经系统发挥作用，毒素由于抑制了前突触点（pre-synaptic sites）的乙酰胆碱的合成与释放，阻滞了神经冲动的传导。毒素在起始阶段损害延髓的运动中枢，以后随着疾病的发展而损害外周肌肉纤维，阻滞神经肌肉接头突触中的神经细胞释放乙酰胆碱而导致肌肉麻痹。
毒素作用是目前已知的化学毒物、生物毒素中最为强烈的，比氰化钾的毒性还强1万倍。毒素在消化道内不被破坏。液体中的毒素在100℃经15～20min才可被破坏，在固体食物中则经2h才可被破坏。精制毒素1μg的毒力为200000只小白鼠（20g/只）致死量，也就是说，1g毒素能杀死400万t小白鼠，一个人的致死量大概1μg。1899年至1990年，在美国共有2305人中毒，经检测，303人感染A型毒素，92人感染B型毒，3人感染E型毒素，2人感染F型毒素，有两起中毒事件是由A、B两种毒素引起。F、G两种毒素主要引起动物肉毒中毒，尚未得到深入研究。
4 检测方法
肉毒毒素中毒的实验室诊断，国内主要以国标GB478912—2016为标准。从病人的血清、粪便、胃肠内容物、呕吐物及可疑食品等样品中检测到肉毒毒素是最可靠的诊断依据。可见，检出污染物中存在肉毒毒素并鉴定出毒素型别是确定肉毒中毒的关键。但在一些婴儿肉毒中毒病例中，只在粪便或胃肠内容物中发现肉毒梭菌对于肉毒中毒的确诊已足够，即使在样品中检测不到肉毒毒素。
4.1 分离鉴定
肉毒梭菌检验方法的重点乃是产毒及毒素的检出试验，如要证实是否有肉毒梭菌存在，只要分离、培养、鉴定即可。
（1）样品前处理 无菌称取25g样品，移入灭菌的均质器中，加入225mL明胶磷酸盐缓冲液，均质成匀浆。
（2）预增菌 将样品分别接种于疱肉培养基、胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤（TPGY）培养基，并分别于35℃、26℃培养7d。
（3）分离培养 培养7d后，染色、镜检，观察菌的形态是否为典型的肉毒梭菌。如有细菌生长，离心、取上清液接种于血平板和乳糖牛奶卵黄琼脂平板，于35℃厌氧培养48h后涂片，显微镜观察。
典型菌落是隆起或扁平，光滑或粗糙，在卵黄培养基上用斜光照射检验时菌落表面通常出现虹晕色，此光区称为“珍珠层”（G型无此特性），C、D、E型菌通常有2～4mm黄色沉淀区围绕，A、B型菌通常显示较小的沉淀区。
挑取典型菌落，分别接种于疱肉培养基、TPGY培养基，并分别于35℃、26℃培养7d，再取培养物进行培养特性检查或肉毒毒素检测即可。
（4）培养特性检查 挑取可疑菌落接种于2份卵黄琼脂平板，分别于厌氧或需氧条件下培养48h，观察。如需氧条件下无细菌生长，而厌氧条件下有细菌生长，并有虹彩样薄层，证明有肉毒梭菌存在。
4.2 肉毒毒素检测
液体样品可直接离心，固体或半固体样品需加适量明胶缓冲液，浸泡、研碎，然后离心，取上清液进行检测；另取1份上清液，调pH至6.2，按1/10的量加10%胰酶（活力1:250）水溶液，混匀，不断轻轻搅动，37℃作用60min进行检测。肉毒毒素检测以小鼠腹腔注射法为标准方法。
（1）检出试验 取离心上清液及其胰酶激活处理液分别腹腔注射3只小鼠，每只0.5mL，观察4d。注射液中若有毒素，小鼠一般多在注射后24h内发病、死亡。主要症状为立毛、四肢瘫软，呼吸困难，呈风箱式呼吸，腰部凹陷，最终死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以致临床症状不明显，则可将注射液做适当稀释，重做试验。
（2）中和试验 分3组进行，各取1mL被检毒素液，第1组（毒素中和组），加等量多型混合肉毒抗毒素，混合后置37℃作用30min；第2组（毒素灭活对照组），加等量缓冲液，混匀后煮沸10min；第3组（毒素对照组）加等量缓冲液即可。3组混合液分别腹腔注射小鼠各2只，每只0.5mL，观察4d。若第1组和第2组小鼠均获保护存活，而第3组小鼠以特有症状死亡，则可判定为肉毒毒素存在；若第1组也不存在，则说明该毒素不是肉毒毒素，必要时需进行毒素定型试验。
（3）毒力测定 取已判定含有肉毒毒素的检样离心，取上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成50倍、500倍及5000倍的稀释液，分别注射小鼠各2只，每只0.5mL，观察4d。根据小鼠死亡情况，计算检样所含肉毒毒素的大致毒力（MLD/mL或MLD/g）。例如5倍、50倍及500倍稀释致小鼠全部死亡，而注射5000倍稀释液的小鼠全部存活，则可大致判定检样上清液所含毒素的毒力为1000～10000MLD/mL。
（4）定型试验 按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大致在10～1000MLD/mL，分别与各型肉毒毒素诊断血清等量混合，置37℃作用30min，各注射2只小鼠，每只0.5mL，观察4d。同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与稀释毒素液等量混合作为对照。能保护小鼠免于发病、死亡的诊断血清型即为检样所含肉毒毒素的型别。
注：①未经胰酶激活处理的检样的毒素检出试验或确证试验若为阳性结果，则胰酶激活处理液可省略毒力测定及定型试验。②为争取时间尽快得出结果，毒素检测的各项试验也可同时进行。③根据具体条件和可能性，定型试验可酌情先省略C、D、F及G型。④进行确证及定型试验时，检样稀释应参照所用肉毒诊断血清的效价。⑤试验动物的观察可按阳性结果的出现随时结束，以缩短观察时间；唯有出现阴性结果时，应保留充分的观察时间。
4.3 分子生物学方法
4.3.1 肉毒梭菌的PCR检测方法
PCR技术灵敏度高，在有大量杂菌存在时也不产生干扰。但该法检测的是肉毒梭菌菌体内的毒素编码DNA，并不能测定污染样品中是否含有毒素蛋白，只鉴定出食物有肉毒梭菌污染，并不能说明食物中毒的原因就是肉毒毒素。
（1）分离纯培养物 按前述方法进行增菌培养，然后取1～2mL培养液置于螺旋帽试管中，加入等量过滤除菌的无水乙醇，混匀，在室温下放置1h；或80℃加热10～15min，以破坏其繁殖体。
用接种环取1～2环经乙醇或加热处理的培养物在厌氧卵黄琼脂上划线接种，置（35±1）℃厌氧条件下培养48h。挑取约10个单个的典型菌落。接种可疑菌落到TPGY培养基中，置（35±1）℃厌氧条件下培养24h。
（2）模板DNA的制备 以下两种方法任选一种。
热裂解抽提DNA法：取1.4mL TPGY培养物转移至15mL离心管中，14000g离心2min，弃去上清液。加入1.0mLPBS悬浮菌体沉淀，14000g离心2min，弃去上清液。用400μLPBS重悬沉淀，加入10mg/mL溶菌酶溶液100μL，（37±1）℃水浴15min，期间每5～7min颠倒混匀离心管。加入10mg/mL蛋白酶K溶液10μL，（60±1）℃水浴1h，期间每10～15min颠倒混匀离心管。沸水浴10min，14000g离心2min，将上清液转移至新的灭菌1.5mL离心管中。加入3mol/L乙酸钠（NaAc）溶液50μL和95%乙醇1.0mL，颠倒混匀，－70℃或－20℃放置30min，14000g离心10min，弃去上清液，沉淀干燥后溶于200μLTE（TrisＧEDTA）缓冲溶液。测定纯度和浓度后置于－20℃保存。
试剂盒抽提DNA法：取1.4mLTPGY培养物转移至1.5mL离心管中14000g离心2min弃去上清液。菌体沉淀用1.0mL TE缓冲液洗2次后重悬于120μL的25%蔗糖溶液中。加入10mg/mL溶菌酶溶液120μL，混匀，（37±1℃）水浴30min；然后加入20%SDS溶液30μL，轻轻混匀，室温放置5min；再加入10mg/mL蛋白酶K溶液9.0μL，混匀后（37±1）℃水浴30min。悬浮液采用商品化细菌基因组DNA提取试剂盒提取DNA，使用时按照试剂盒说明书进行操作。对提取的DNA进行纯度和浓度测定后置于－20℃保存。
（3）核酸（DNA）纯度和浓度的测定 取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后，使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸光值。DNA的浓度按照式（1）计算。
c＝A260×N×50； （1）
式中，c为DNA浓度，单位为μg/mL；A260为260nm处的吸光值；N为核酸稀释倍数。
当DNA浓度为0.34～340μg/mL，A260/A280比值在1.7～1.9时，适宜于PCR扩增。
（4）PCR扩增 采用分别针对肉毒梭菌的A、B、E、F型肉毒毒素基因设计的型特异性引物，进行多个PCR扩增，每个PCR反应管检测一种类型的肉毒梭菌。检测时反应体系应设置阳性对照、阴性对照和空白对照。用含有扩增片段的质粒或A、B、E、F型肉毒梭菌的基因组DNA做阳性对照，用非肉毒梭菌基因组DNA做阴性对照，用无菌水做空白对照。
（5）凝胶电泳检测PCR产物 用0.5×TBE缓冲液制备1.2%～1.5%（质量浓度）的琼脂糖凝胶（凝胶加热融化后冷却至60℃左右加入溴化乙锭至0.5μg/mL，或者在电泳后用0.5μg/mL溴化乙锭溶液进行染色），将1.0μL的PCR产物与2.0μL6×加样缓冲液混合，点样，其中一孔加入DNA分子量标准物，以判断PCR产物的片段大小。0.5×TBE电泳缓冲液，10V/cm恒压电泳，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定，电泳检测结果用凝胶成像系统记录。
（6）PCR检测结果判定 阴性对照和空白对照均未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带，待测样品出现预期大小的扩增条带，判定为PCR检测结果阳性。
4.3.2 核酸探针诊断技术
核酸探针也称DNA探针，特点是特异性好、灵敏度高、检测速度快、一次可检出大量标本，尤其可检查单个菌落的产毒特性，无须专门产毒培养。细菌毒素探针制备通常取自病原菌染色体或质粒毒素基因片段，用于检测毒性相关基因，也可鉴别遗传性状类似的种。
4.4 免疫学诊断
免疫学诊断是目前肉毒毒素检测领域应用最为广泛的检测方法。它可定性定量检测，灵敏度高，特异性好，一次可检测大量标本，能自动化。免疫学诊断检测的一个缺点是必须要有高亲和性抗体，而且该方法不能区分毒素是否具有活性。另外，毒素基因的变异会导致检测抗体与毒素的亲和力降低，出现假阴性结果。目前有以下几种检测方法常被采用。
4.4.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）
ELISA是目前使用较为广泛的肉毒毒素检测方法，毒素检测和型别鉴定只需5～6h。尽管抗体来源、酶底物不同，但检测原理基本一致。最常用的是双抗体夹心ELISA法。酶联板上包被检测用单克隆抗体或多克隆抗体，加入可疑样品（待测抗原）后，再加入另一种酶联抗体，待测抗原被带有标记物的二抗捕获后，通过标记物与底物的显色反应来判定结果。美国建立的双抗体夹心ELISA法已经被国家药品监督管理局（SDA）和分析化学家协会（AOAC）批准成为第二个官方认可的检测方法。
4.4.2 胶体金免疫层析法
该技术以胶体金作为示踪标记物，利用抗原抗体的高度专一结合特性及胶体金标记技术的可视定位特性来检测可疑样品。此方法具有如下优点：检测快速，通常可在5～10min出结果；检测试纸条比较稳定，可长期保存；成本相对较低，易于推广；操作简单，操作者无须特殊培训。此技术在毒素检测领域有巨大的发展潜力。
4.4.3 免疫印迹分析
肉毒毒素经电泳转移至硝酸纤维膜上，进行免疫印迹反应；毒素浓度与免疫印迹反应条带密度之间存在良好的线性关系。
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| 文章作者：曲志娜 赵思俊等 中国兽医发布 文章编辑：一米优讯 |
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