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鸡场实用新型大肠杆菌、沙门氏菌自家菌苗
□刘会芳 （河北省石家庄市神九畜禽疾病防治及药物研究所 050051）
刘兴林 陈桂清 （河北省泊头市农业局 062150）
鸡大肠杆菌病和沙门氏菌病已成为众多商品代养鸡场和种鸡场的背景性疾病。这两种病主要能够造成种蛋质量下降、雏鸡成活率降低、蛋鸡育成鸡与肉鸡整齐度差、成年产蛋鸡产蛋率低，死淘率高等情况，常常给养殖场和种鸡场造成了持续性损失。耐药菌株的出现不但给鸡场增加了用药负担，还使得疾病反复“发作”，用药时好一些，停药就复发，效果很好的新药用不了一两年，效果就明显下降。另外，曾被寄于厚望的大肠杆菌沙门氏菌疫苗也因只对个别鸡场（养殖户）有效而对其他大多数用户效果不佳或无效果而无法推广。造成大肠杆菌沙门氏菌耐药的主要原因是什么？如何解决兽医“用药难、难用药”的窘境？大肠杆菌沙门氏菌疫苗有那些优势和劣势？如何制造出价廉优质的新型疫苗？新型实用疫苗的主要内容是什么？又要注意一些什么问题？以下围绕这些问题进行论述，给相关科研人员和生产管理人员以参考，以得指正，以求提高。
1细菌耐药性形成的主要原因及危害
1.1细菌耐药性形成的原因
目前，大肠杆菌与沙门氏菌出现耐药性的主要原因是鸡场大量与超范围用药所致。在药物的选择作用下，不耐药菌株被消灭，耐药菌株被留下来并大量繁殖。一些耐药菌株产生的耐药因子（质粒）能够在相同菌种或不同菌种间传递，使得耐药菌株与细菌种类快速增加，甚至会出现类似我们人类中目前出现的“超级（耐药）细菌”。
1.2大量用药与超范围用药的危害
大量和超量用药，能够诱导耐药菌株产生的世代提前。而超范围使用人药来治疗鸡场的细菌病，会使鸡场中很快出现耐人药的菌株。这些耐药菌株的出现不但对养鸡业来说是个坏事，而且对人的食品安全也是个威胁。由于细菌的一些耐药因子（质粒）能够在相同菌种或不同菌种间传递，所以畜禽中出现的耐药菌株也具有一定的公共卫生学意义。
当前新药的开发潜力有限且投入巨大，赶不上细菌的耐药性增加的速度。如何解决这种困境呢？一种行之有效的方法就是进行细菌疫苗的防疫。那么疫苗的效果如何呢？
2大肠杆菌与沙门氏菌疫苗的情况
大肠杆菌与沙门氏菌菌苗有多种形式，现有水苗、铝胶苗、油乳剂苗、蜂胶苗等。菌苗曾被寄于厚望，许多科研工作者都曾进行研究。但实际应用上效果却不理想，除了采自本场的细菌做的自家疫苗效果很好外。一旦向外推广，效果就大打折扣。原因何在呢？
2.1菌苗应用不理想及推广失败的主要原因
因为沙门氏菌中的鸡白痢伤寒沙门氏菌是种鸡应该进行检疫的菌种，其讨论将放到后面。下面以大肠杆菌为例来说明菌苗效果虽好但应用推广不理想的问题，菌苗应用不理想的主要原因有以下几项：一是大肠杆菌血清型很多，其毒力是多因子共同作用的结果，不单是O、H、K抗原决定其毒力的，还有很多因子也起着重要作用，如大肠杆菌气杆菌素（aer）、温度敏感性血凝素（tsh）、铁基因簇（iro）、强毒力岛（HPI）、肠细胞脱落毒力岛（LEE）、耐热毒素（HST）、形成空泡的自转运毒素（VAT）等。就是同一血清型的大肠杆菌，其病原学生物特性也不尽相同。所以在菌苗研发上，试图找到一个或几个菌株就能代表某一地区所有的大肠杆菌，是不可能的。这也是一些科研单位和一些疫苗厂为什么总想采几个有代表性的菌株，就去搞某一地区所有的鸡的防疫，实际效果总是很差的根本原因；二是菌苗灭活物质和内毒素的副作用，国内和国外对大肠杆菌的毒素没有做要求，关于菌苗的灭活物质--甲醛的纯含量
都是不大于0.1%，但两者仍对鸡有一定的副作用，一般表现为发蔫、食欲不振和产蛋下降。实际生产中，细菌的灭活浓度常高达0.3%以上，此时疫苗给鸡注射会出现更明显的副作用，表现为时间更长的发蔫和更严重的降蛋，有关试验数据显示，低甲醛注射会引起鸡血清中的雌二醇（E2）含量下降25%，此时产蛋下降2%；超标达8倍的甲醛给鸡注射，雌二醇含量下降则为60%，产蛋下降20%。所以实际生产中的甲醛超标和含有的内毒素是疫苗表现不佳的第二个重要原因。我们对400多株大肠杆菌和500多株沙门氏菌利用鲎制剂法进行测定，其灭活菌液菌数在60亿/毫升左右时，内毒素含量大体在20~60万活性单位（EU）/毫升。所以种鸡场和商品代养鸡场一般对副作用大的菌苗都有抵触情绪；三是大规模生产疫苗都是利用细菌培养液进行反应缸（发酵罐）生产。菌液收获时，仍有一部分培养液成分进入菌苗制作之中，这些成分对疫苗来说都是杂质，对被注射鸡来说都是不必要的外源性抗原，会产生一些不必要的应激；四是大规模生产与小应用量之间的矛盾。工业化生产菌苗，单班产量就可能是100万头份。而中国的养殖主体，从商品代养殖场来说，5000只以上的就是大户；从种鸡场来说，2万到5万套的种鸡场是主体；它们不可能一次购买这么多的量的疫苗。从鸡场大肠杆菌病本身来说，从本场提取的菌株效果最好，从其他场中提取的菌株就可能无效，所以只可能采购本场提取的菌株的头份的产品；反过来对疫苗厂来说，巨大的生产能力，每次只有一个养鸡场使用，从商业角度来说，干脆赔钱，即使将几个养殖场的细菌放到一块培养，也增加不了多少销量。同时无关的或关联度较低的细菌的加入对使用菌苗的鸡场来说，也是不合适的。
2.2原因总结与解决思路
目前从养鸡场或种鸡场自身提取的细菌做苗，效果最好。但细菌本身的病原特殊性，使得此菌苗应用到另外的鸡场就可能完全无效或效果很差。细菌病原学的特性使得只有自家菌苗效果好，这与菌苗生产企业的巨大产能出现了矛盾。在目前情况下，这个矛盾无法解决。那有没有新的解决方法呢？
新的方案，要解决以下这几个问题：一是要做自家菌苗，剂量在5000到5万头份之间；二是要除去大部分的甲醛或内毒素，以减少菌苗应用中的主要副作用；三是菌苗要纯净，避免带入不必要的生产杂质。
3新型实用大肠杆菌沙门氏菌自家苗的制法与应用
根据以上方案，可以采取新的思路来制作效果好副作用又很小的新型实用的大肠杆菌沙门氏菌菌苗。其主要原理如下：采用平皿固体培养基培养的方法，因无培养液，菌中杂质降到最低程度；且产量可大可小，不再受工业生产用的大反应缸（发酵罐）的束缚；利用离心法除去绝大部分灭活物质和内毒素，让菌苗的副作用降到最低。其利用原理就是菌体是大颗粒物质，可以在离心作用下沉淀，而甲醛易溶是良好的溶质，内毒质作为小颗粒物质，也可看作是溶质。通过离心方法可以实现它们与细菌的分离。
通过这种固体培养加菌体离心的方法可以解决困挠菌苗生产的几个难题。实现大型养殖场自己制作自家菌苗的愿望。
3.1菌苗制作的具体步骤
3.1.1细菌的提取和纯化
直接从病鸡肝脏中提取细菌，培养并鉴别。一般要用O型单因子血清对细菌进行分型。并标号，再重新进行平皿培养。
3.1.2细菌扩增与增养
将纯化重新长出的细菌转移至试管培养液(如马丁肉汤、营养肉汤等)扩增12~24小时，当细菌数在10亿/毫升时，接种到营养琼脂平皿上。37℃培养24~36小时，用生理盐水和无菌刀片或无菌铂丝收获。
3.1.3细菌灭活
菌液加0.1%甲醛灭活24~48小时，其间通气并定时摇动。定时检测。检测应无活菌生长。
3.1.4离心与水洗
根据菌苗需要量选择不同的离心机在无菌条件下进行离心。弃去上清，将沉淀下的菌泥用生理盐水进行洗涤，根据需要可进行多次离心与水洗，直至达到设计要求为止。其间甲醛测定使用乙酰丙酮分光光度法，内毒素测定用鲎制剂法。一般甲醛浓度在0.003%~0.004%以下、内毒素浓度低于0.2~0.4万活性单位（EU）/毫升时，菌苗对鸡使用就没有眼观副作用了。
3.1.5菌苗制作
根据实际需要，菌苗可以制作成水苗、铝胶苗、油乳剂苗、蜂胶苗等多种形式。一般以水苗和铝胶苗为主。由于固体培养细菌并离心，所以细菌含量很高，可以根据自己鸡场的实际情况在10~100亿/毫升之间自由选择。
3.2菌苗的应用
3年多来，应用此技术做菌苗，在全国十几个省237万套种鸡、125万只商品蛋鸡上使用，未见有副作用，产蛋高峰期使用也未对生产性能产生不利影响，未发现一例降蛋过程。一般菌苗的免疫期长约3~6个月，此外，鸭、鹅、山鸡等也使用此技术做菌苗，亦未发现有毒副作用，免疫期也得到与鸡使用相近的结果。
4实用新型菌苗的有关问题
4.1关于沙门氏菌中的鸡白痢伤寒沙门氏菌的问题
种鸡企业应严格按照国家的有关规定，对鸡白痢伤寒沙门氏菌进行检测并淘汰阳性鸡，至于未检测出的带菌鸡可通过再次检测进行再次淘汰。对于鸡白痢伤寒多价抗原不能检出的变异鸡白痢伤寒沙门氏菌菌株，则可以通过将细菌提出来做菌苗的措施。当然，变异菌株感染的种鸡最终还是要靠研制新的抗原来解决。其他类沙门氏菌如沙炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等则可通过做自家菌苗来做一些防控工作。
4.2为什么不做自家组织苗
自家组织苗是在对付疾病没有办法时的一种应急手段，不是常规用的菌苗。这是因为，病理组织里的细菌量有时很少，不能起到免疫效果；而且病理组织里有可能有其他的细菌或病毒，一旦处理不好，反而会产生不利的作用。
4.3一般菌苗的免疫期有多长，效果如何
就实用新型菌苗的使用情况来看，一般是3~6个月之间。这也看鸡群的具体情况。死淘率、病变情况、攻毒后内脏细菌数、增重数据和抗体水平都可以做相关的技术指标。
菌苗特别是大肠杆菌苗，常能使此类疾病引起的死淘率下降90%，被疾病拖下去的生产性能能明显得到恢复，相应用药也下降80%以上。经济效益十分明显。
需要指出的是沙门氏菌菌苗的效果没有大肠杆菌好，这是因为沙门氏菌既是胞内菌又是胞外菌，沙门氏菌的免疫既有体液免疫又有细胞免疫，所以沙门氏菌单纯的灭活苗并不能取得大肠杆菌苗那样的效果。不过它仍能阻挡沙门氏菌对机体进一步的大量的侵害，同时也能阻挡细菌的大量垂直传播。
4.4眼型大肠杆菌与沙门氏菌菌苗
有时，种鸡会发生眼型的大肠杆菌病和沙门氏菌病，这些细菌常常与体内菌没有关系。这些细菌要单独提取出来做苗。
5用药与菌苗的关系
新型大肠杆菌沙门氏菌菌苗能够有效地抑制细菌繁殖和传播。特别是大肠杆菌病，一个鸡场连续做1~2年菌苗，病菌会下降到很低的程度，很少用药，即使用药效果也明显。这么就能摆脱以前大量超量用药的不利局面。对食品安全和公共卫生安全也是一个不小的贡献。
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