猪病轻简化实用快速诊断技术与应用

现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2015/8/27 8:27:17 关注：250 评论： 我要投稿

　　诊断是有效控制和消灭疫情的基础。在猪病诊断中，根据临床症状和病理变化特点，可以对疫病做出初步诊断。但是，近年来猪病的传染源、传染媒介、传染途径极其复杂，多种猪病交叉混合感染情况比较普遍，仅仅通过临床症状和病理变化特点进行猪病诊断已经变得越来越困难。
　　确诊猪病需要实验室诊断技术，常用的实验室诊断技术包括血清学诊断技术和病原学诊断技术。血清学诊断技术是利用已知抗原来鉴定血清中相应的抗体，或用特异性诊断血清(已知抗体)来鉴定相应的病原体(抗原)，目前较常用的血清学诊断技术包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、凝集试验、沉淀试验、免疫荧光试验(IFA)、血清中和试验等。病原学诊断技术包含病毒分离鉴定、病毒中和试验(VN)、常规聚合酶链式反应(PCR)和实时定量PCR、本动物回归试验和实验动物感染试验等。猪病实验室诊断技术虽然能够提供精确的检测结果，但需要多种仪器设备，操作也比较复杂，依赖专业技术人员在实验室里才能完成。
　　免疫层析试纸快速检测技术(ILFST)又称侧流免疫检测技术(LFA)。免疫层析试纸技术具有操作简便、快捷、操作人员无需技术培训、无需特殊仪器设备、检测结果清楚直观、试剂稳定和便于保存等特点，适用于现场快速检测。本文简要介绍了免疫层析试纸快速检测技术在猪病诊断领域的应用。
　　1 免疫层析试纸快速检测技术
　　免疫层析试纸快速检测技术的基本原理形成于20世纪80年代。Leuvering等报道了以无机(金属)胶体颗粒为标记的溶胶颗粒免疫检测技术(SPIA)，他们用胶体金或银颗粒标记抗体，建立了人胎盘催乳激素(HPL)和人绒毛膜促性腺激素(HCG)的夹心免疫检测方法，高浓度抗原的检测结果可直接通过肉眼判定。随后，Leuvering研究小组利用单克隆抗体建立匀相SPIA方法，对血清和尿中HCG和促黄体激素(LH)进行鉴别检测。20世纪80年代后期，随着美国BD公司、联合利华和Carter Wallace等公司对该检测方法主要技术环节的专利申请，免疫层析试纸快速检测技术得以全面建立。
　　20世纪90年代以来，河南省农业科学院动物免疫学重点实验室系统开展了免疫层析试纸快速检测技术研究，率先在国内建立了抗原、抗体、半抗原3大类免疫层析试纸快速检测技术平台。
　　抗原快速检测技术研究，建立了动物病毒的高特异性、高亲和力配对单克隆抗体制备新方法，解决了试纸研制中抗原变异大、抗体亲和力低、识别谱窄等技术难题，形成了抗原免疫层析试纸快速检测技术体系，研制出动物疫病抗原快速检测试纸系列产品。2003年“畜禽疫病快速诊断试纸条”获国家发明专利，其中“鸡传染性法氏囊病病毒快速检测试纸条”是国内外第一个动物疫病快速检测试纸产品，2003年获国家二类新兽药证书，2004年获国家技术发明二等奖。上述研究开辟了动物疫病快速诊断的新领域，为动物疫病的快速检测提供了新的技术支撑。
　　半抗原快速检测技术研究，建立了小分子化合物的人工抗原合成，以及高特异性、高亲和力单克隆抗体制备与鉴定方法，解决了小分子化合物免疫原性差、抗体亲和力低等技术难题，形成了半抗原免疫层析试纸快速检测技术体系，研制成功了小分子化合物快速检测试纸系列产品，实现了药物残留的简便、低成本快速检测，其中“生猪主要违禁药物残留免疫层析试纸快速检测技术”2008年获国家科技进步二等奖，为动物源性食品安全监控提供了技术保障。
　　抗体快速检测技术研究，建立了口蹄疫病毒、猪瘟病毒、旋毛虫等多种病原的检测抗原制备方法，解决了免疫检测抗原活性低、非特异性反应高、提取制备难等技术难题，形成了抗体免疫层析试纸快速检测技术体系，研制出动物疫病及人兽共患病抗体快速检测试纸系列产品，实现了动物疫病抗体水平的实时监测，其中“猪旋毛虫抗体快速检测试纸条”2007年获国家二类新兽药证书，2008年获河南省科技进步一等奖，“猪O型口蹄疫抗体检测试纸条”2014年获得国家二类新兽药证书，为疫苗免疫效果评价和动物疫病监测提供了先进的技术手段。
　　2 免疫层析试纸检测技术在猪病诊断上的应用
　　用于猪病诊断的免疫层析试纸，根据待检靶标可分为检测抗原试纸和检抗体试纸。由于病原微生物(细菌、病毒及其他微生物)均可刺激机体产生相应的特异性抗体，因此利用这个原理，通过检测猪血清中的相应特异性抗体可以间接鉴定相应的病原体(抗原)。生产中抗原检测试纸因为样品前处理程序复杂，检测敏感度等因素，应用较少。检测抗体的试纸有更广泛的用途，可用于猪病快速诊断、免疫效果和免疫时间评估，还可用于及早发现养殖场存在的问题和猪病净化等。
　　抗体试纸检测结果可为猪病诊断提供参考。对于没有免疫且未吃初乳仔猪，如果试纸检测结果阳性，提示发生了该病感染;相同免疫背景、相同日龄的猪群如果检测发现某种猪病的抗体水平参差不齐，则提示发生了该病感染;通过采集哺乳母猪及其未免疫的哺乳仔猪的血清同时进行抗体检测，如果哺乳仔猪的抗体水平高于哺乳母猪的抗体水平，则提示哺乳仔猪可能感染了该病。
　　当猪群发生疫情时，分别采集发病时和发病2周左右的血清进行抗体试纸检测，如果发病后的抗体水平升高，则提示有该种疫病感染。经常进行抗体监测的养殖场，如果抗体突然转阳或抗体突然升高(免疫后抗体上升阶段除外)，则提示有该种疫病感染;不经常进行抗体监测的养殖场可根据抗体消长规律来判断，如免疫3个月以上，抗体水平应该下降或转阴，如果抗体水平依然很高，且抗体水平参差不齐，则判断该猪群发生了感染。
　　抗体检测试纸可用于对疫苗免疫效果快速评价。通过检测母源抗体及疫苗免疫效果，确定最佳免疫接种时间，了解和掌握畜禽的免疫状态。猪场每次免疫(首免、二免等)前，先采血检测，根据抗体水平，确定是否适合免疫，确定首免、二免及其他免疫日龄。比如，可用于检测母源抗体的衰减，确定首免日龄。分别在仔猪10日龄(此时其母猪应与仔猪同时采血检测)、20日龄、断奶当天、断奶后10天、断奶后20天采血进行检测，判定母源抗体的衰减情况，确定首免日龄。仔猪在首次免疫前1～3天采血进行抗体检测，免疫后14天和28天分别采血进行抗体检测，根据抗体水平判断疫苗免疫效果和加强免疫时机。加强免疫前1～2天和加强免疫后28天分别采血进行抗体检测，以后每隔30天检测一次，直至下一次免疫前。通过抗体试纸检测结果对猪场免疫程序适时调整。
　　3 免疫层析试纸检测技术研究进展
　　3.1 猪旋毛虫病抗原和抗体快速检测试纸条研制
　　旋毛虫病(Trichinellosis)是一种人畜共患的寄生虫病，其感染宿主众多，流行范围非常广泛，传播途径复杂，可感染人和150多种动物。目前全世界各地区均有本病发生，对人类身体健康造成很大威胁，同时对养猪业、肉食品加工业、外贸出口业也造成了巨大的经济损失。旋毛虫感染猪后几乎不表现任何临床症状，这给旋毛虫病的诊断和控制带来一定的困难。
　　疫病控制研究室通过基因工程技术制备旋毛虫肌幼虫特异性排泄-分泌抗原(ESAg)高效重组蛋白，制备特异性ESAg高亲和力单克隆抗体，研制出用于诊断猪旋毛虫病的抗原和抗体快速检测试纸。试验结果显示，该试纸与猪肺线虫、猪囊尾蚴、猪细颈囊尾蚴、猪米氏住肉孢子虫、猪蛔虫无交叉反应，表明旋毛虫病试纸具有良好的特异性和敏感性，其敏感性与ELISA相当，与ELISA及消化法的检测结果符合率为100%，成为国内第一个获得国家新兽药证书的人畜共患寄生虫病检测试纸。该研究先后获得国家二类新兽药证书和河南省科技进步一等奖，推动了行业技术进步与发展。
　　3.2 猪O型口蹄疫抗体快速检测试纸条研制
　　口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒引起猪、牛、羊等多种偶蹄动物的一种高度接触性传染病。目前除了发达国家外，大多数发展中国家都通过疫苗接种的办法来控制该病的流行。免疫动物的口蹄疫抗体水平评价、自然感染动物和注射疫苗动物的鉴别诊断是FMD防制中迫切需要解决的问题。国内外采用的FMD抗体检测方法主要有液相阻断ELISA及非结构蛋白鉴别诊断ELISA。这些方法虽然具有特异、敏感等优点，但操作复杂、费时、费力，且需特定的仪器设备和专业技术人员，很难在基层普及推广。
　　疫病控制研究室利用分子克隆、合成多肽、单克隆抗体和免疫膜层析等技术研制成功具有自主知识产权的猪O型口蹄疫免疫抗体评价快速检测试纸，该试纸检测免疫30 d的猪血清样品时，敏感性可以达到1:12800，与A型、Asia 1型FMDV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清无交叉反应。同时，用固相合成FMDV非结构蛋白2B、3B和2C的抗原表位多肽，以此作为抗原，建立了试纸，试验证实该试纸可以用以区分FMDV感染与免疫动物。
　　3.3 猪瘟抗体检测试纸
　　猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染传染病。具有高度传染性和致死性。中国的猪瘟兔化弱毒疫苗已被公认为一种安全性良好、免疫原性优越、遗传性稳定的弱毒疫苗，但如何评价疫苗免疫效果是制约猪瘟防控的关键问题。目前常用的实验室检测技术包括IFA、ELISA、血清中和试验等，其中阻断ELISA在生产中广泛应用。
　　为实现猪瘟疫苗免疫评价轻简化目标，我们以猪瘟病毒CSFV Erns/E2嵌合重组蛋白为检测抗原，研制了用于猪瘟抗体快速检测试纸，该试纸和其它病毒阳性血清无交叉反应。临床试验研究表明，利用猪瘟抗体检测试纸和阻断ELISA试剂盒符合率为84.1%。为评价猪瘟抗体检测试纸条的性能，开展了猪瘟抗体消长规律的检测试验。用研制的试纸条检测抗体变化规律，同时用商品化猪瘟抗体检测试剂盒做平行对比试验，检测结果表明，二者抗体变化规律基本一致。表明猪瘟抗体检测试纸可作为快速检测猪瘟血清抗体的检测方法。
　　4 免疫层析试纸检测技术发展展望
　　免疫层析试纸快速检测技术是一个非常适合实时和现场检测的成熟技术，具有通用的检测模式，设备和工艺已经比较完备，研发时间短，产品上市快，易于大规模批量生产。然而，传统的免疫层析试纸快速检测技术同时检测多个靶标尚存在困难，整合便捷式电子设备和质量控制面临挑战，定量检测受到限制。上述限制因素在常规胶体颗粒、材料和标记等传统试纸生产工艺和目视检测应用过程中日益突出，最近系列新型材料、试剂、检测方法、读卡系统和生产工艺的改进使得免疫层析试纸技术取得很大发展，在各个领域均得到广泛应用。
　　随着该技术的广泛应用，进一步提高试纸的灵敏度、特异性，实现多重检测、定量检测是未来免疫层析试纸快速检测技术的发展方向，利用生物素亲和素系统或免疫金银染色等信号放大系统，以及量子点(Quanrum dots)或上转荧光等新型标记技术，结合相应的便携式仪器设备，实现试纸的高灵敏度检测;在检测膜上喷点不同的检测试剂建立集成化试纸，在同一膜上进行多靶标测定，实现试纸的高通量检测;研究开发便携式试纸检测设备或应用程序，实现试纸的数字化检测。