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高原地区氧气稀薄，这对生存在此的动物是严峻的挑战。当把低地商业家禽品种迁移至高原孵化时，其胚胎受到低氧的影响，代谢下降、发育延迟、死亡率升高，胚胎孵化率较低。但是藏鸡作为生活在青藏高原的古老鸡种，对高原的低氧环境有良好的适应性，其可以正常孵化，高原孵化率高于低地鸡。
最近有研究发现，低氧诱导因子(Hypoxia inducible factor, HIF)通路中EGLN1基因在藏族人和安第斯人相关高原低氧适应的全基因组选择信号分析中都受到了强烈地正向选择。EGLN1基因及其所在的HIF通路被认为是藏族人适应低氧的一种重要机制。
EGLN1属于Fe-2-酮戊二酸双加氧酶超家族。其产生羟化反应时需要氧气作为共同底物。因此，EGLN1也被认为是一种新的氧气感受器。由于EGLN1基因在氧气稳态中重要作用，本研究以藏鸡、白来航鸡孵化至16天的胚胎为研究对象，分析了常氧和低氧条件下藏鸡和白来航鸡胚胎肝脏EGLN1基因mRNA的表达情况，进而使用Western-blot方法对其蛋白表达量进行研究，从而揭示藏鸡和低地鸡EGLN1基因在常氧和低氧情况下的表达状况。
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材料与方法
实验材料
收集来自中国农业大学试验鸡场藏鸡、白来航鸡3 d内的种蛋，并将藏鸡和白来航鸡的种蛋随机分成2组，分别在21%、15%氧浓度下孵化。孵化温度、湿度均维持在37℃和60%。孵化至16 d，采集21%、15%氧浓度条件孵化的藏鸡和白来航鸡胚胎肝脏组织各8个，液氮冷冻后，放入-80℃保存备用。
实验方法
组织总RNA提取及反转录
肝脏组织的总RNA严格按照说明书使用TRIZOL kit(美国Invitrogen公司)提取。
引物设计和合成
根据GenBank提供鸡EGLN1基因(XM_001231253.3)的cDNA序列设计特异性引物，同时选用次黄嘌呤磷酸核糖转移酶1(hypoxanthine phosphoribosyl ltransferase 1 HPRT1)基因(NM_204848.1)作为内参基因，进行Realtime-PCR 扩增。
Real-time PCR
用定量引物常规PCR扩增目的基因和参考基因。
使用Bio-Rad C1000荧光定量PCR仪进行扩增反应。
Western blot
使用TRIZOL kit（美国Invitrogen公司）进行蛋白提取。操作过程严格按照说明书中提供的步骤进行。蛋白提取后使用BCA蛋白质定量试剂盒进行蛋白定量。
数据处理与统计分析
采用双标准曲线法对相对定量的结果进行分析。目的基因和内参基因mRNA表达量由软件Bio-Rad CFX Manager Version 1.5通过标准曲线校准后获得。各组数据均用平均值±标准误来表示，使用SAS 9.1.3(SAS Inst. Inc, Cary, NC)统计分析软件的GLM过程进行数据的显著性检验。P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为极显著差异。双因素最小二乘模型为：
Yij= μij + Oi + Bj+Iij +eij,
Yij为观察值μij为群体均值，Oi表示氧浓度效应，Bj品种效应，Iij表示氧浓度和品种效应之间的互作，eij表示为随机残差。
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结 果
不同氧浓度条件下不同鸡种胚胎肝脏EGLN1基因mRNA表达量孵化至16 d鸡胚肝脏组织中EGLN1基因表达量见图1。氧浓度对EGLN1的表达量有极显著的影响（P<0.01），随着氧浓度的降低，EGLN1基因的表达量下降。品种效应没有显著的影响。而品种与氧浓度的互作却产生了明显的作用。在常氧条件下，藏鸡和白来航鸡的表达量没有显著的差异；在低氧条件下，白来航鸡EGLN1基因的表达量显著低于藏鸡（P<0.05），而且随着氧浓度的下降，白来航鸡EGLN1表达量明显下降。
不同氧浓度条件下EGLN1基因肝脏蛋白表达量
Western blot方法检测了该蛋白在肝脏中的表达。在肝脏中，白来航鸡EGLN1表达量随着氧浓度的下降显著下调（P<0.05）。在低氧条件下，白来航鸡该蛋白的表达量显著低于藏鸡（P<0.05）。不同鸡种中，随着氧气浓度变化而变化的EGLN1蛋白表达量的趋势与EGLN1基因mRNA在肝脏中表达量的变化趋势一致。
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讨 论
本试验发现，随着氧浓度的下降，白来航鸡EGLN1表达量明显下降。EGLNs是Fe-2-酮戊二酸双加氧酶超家族成员，在氧浓度的调控下催化HIF发生羟化反应。在羟化反应中，EGLNs催化其中一个氧原子与肽基脯氨酸形成加氧脯氨酸；另一个氧原子参加双脱羧反应使酮戊二酸转换成琥珀酸。低氧时，白来航鸡为了增加HIF-l在组织表达量，以维持生物体稳态、降低EGLN1表达量、减少对HIF-l降解，即使得有足够的HIF-1参与对低氧反应基因进行转录调控（如促红细胞生成素、血管内皮生长因子、血红素氧化酶-1、诱导型一氧化氮合酶等），从而提高细胞和组织对缺氧环境的耐受。
除了氧气含量以外，其他因素也可以影响EGLN1基因的表达量。EGLN1基因序列中有低氧反应元件(hypoxia response elements HRE)，因此在低氧时HIF-1可以直接作用于HRE元件从而对EGLN1基因进行调控。由于HIF-1对EGLN1的负反馈机制，在缺氧时，HIF的积累导致EGLN1表达量的增加，藏鸡由于其适应性，EGLN1表达量由氧气含量直接调控的减少量和HIF负反馈调节的增加量维持在稳态，因此，在低氧条件下，EGLN1的表达量未受较大影响。而对于白来航鸡，氧浓度的下降导致白来航鸡的EGLN1基因表达量显著地下调，最终导致在低氧状况下，藏鸡和白来航鸡的表达量虽然都表现为下调，但白来航鸡的表达量依然显著地低于藏鸡。
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小 结
在低氧状况下，不同鸡种都降低了EGLN1基因mRNA的表达量，但低地鸡的下降幅度要比藏鸡要大。作为最近人类基因组选择筛选出的低氧适应相关候选基因EGLN1，可能通过降低表达量，使HIF-1维持在较高水平，从而应对低氧反应。本研究表明EGLN1基因在藏鸡和低地鸡低氧时的表达存在差异，EGLN1基因在藏鸡低氧适应中可能起着重要作用，但低氧下藏鸡中EGLN1基因如何对HIF-1进行调控，是否存在藏鸡特有且与藏鸡低氧适应相关SNP等问题仍需要进行深入研究。
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