|
王海蓝1，朱振华1，张国祖2*
（1.河南省康星药业有限公司，河南 中牟 451464；2.郑州牧业工程高等专科学校，郑州 450011）
摘要：分别采用超微粉碎技术和普通粉碎技术将黄连解毒散、白头翁汤制成超细微粉和细粉，应用管碟法进行体外抑菌试验，比较超微粉碎对黄连解毒散、白头翁汤体外抑菌效果的影响。结果表明黄连解毒散、白头翁汤超细微粉比细粉水提取液和醇提取液的抑菌圈均大，且差异显著(P<0.05)，说明超微粉碎可明显提高中药方剂的体外抑菌效果。
关键词：黄连解毒散;白头翁汤;超微粉碎技术;体外抑菌
中药超微粉是利用国际领先粉体工程加工工艺对中药实施细胞破壁加工而成的粉剂[1]。经高速粉碎等工艺加工，一般能将物料颗粒粉碎至500目左右[2]，这样不仅破坏细胞之间的胞间层，而且将细胞打碎，其粉碎粉末细度为5～10μm，细胞完全破壁，药材中的有效成分充分释放出来。因此，中药超细微粉能最大限度保留药物的生物活性成分，提高中药有效成分的溶出、吸收、利用，提高生物利用度和药效，同时降低用药量、节约成本[3]。
黄连解毒汤由黄连、黄芩、黄柏和桅子组成。白头翁汤由白头翁，黄柏，黄连，秦皮组成。两方都为清热解毒代表方，主治三焦热盛证，疮黄肿毒，热毒痢疾[4,5]。在兽医临床上，广泛应用于败血症、脓毒血症、细菌性痢疾等多种急性炎症[5,6]。本项目选择黄连解毒散和白头翁汤作为研究对象，采用超微粉碎技术和普通粉碎技术加工黄连解毒散、白头翁汤复方，对两种方法制成的粉末进行体外抑菌效果的研究。通过试验，了解超微粉碎技术对黄连解毒散、白头翁汤有效成分体外抑菌效果的影响，为该技术在中兽药制剂领域中的应用提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
黄连、黄柏、黄芩、栀子、白头翁、秦皮(购于郑州中药有限公司)。
黄连解毒散与白头翁汤按(中华人民共和国兽药典2005版第二部)规定配比而成。
黄连解毒散、白头翁汤超细微粉由开封同创超细粉体技术开发工程中心出品的振动式超微粉碎机加工至300目，黄连解毒散、白头翁汤细粉经普通粉碎机粉碎至65目，试验前40℃减压干燥至恒重。
1.1.1 温水浸泡提取液的制备
称取黄连解毒散、白头翁汤细粉及超细微粉各50g，加10倍药量的蒸馏水，40℃水浴浸泡50min，10000r/min离心10min取上清液，40℃减压蒸发浓缩，浓缩液再离心，上清液用50mL容量瓶定容至50mL，即得1g/mL的温水浸泡提取液，0.22μm滤菌器过滤除菌，4℃保存，备用。
1.1.2 醇提取液的制备
称取黄连解毒散细粉及超细微粉各50g，加入70%乙醇500mL，40℃超声提取10min，静置5分钟，过滤，水浴加热蒸馏乙醇，浓缩液10000r/min离心10min，上清液用50mL容量瓶定容至50mL，即得1g/mL的醇提取液，用0.22μm滤菌器过滤除菌，4℃保存，备用。
1.2 试验器材
超净工作台，隔水式恒温培养箱，9cm玻璃平皿，牛津杯，冰箱，L棒，20μL～200μL微量移液器。
1.3 试验菌株与培养基
1.3.1 菌株
大肠杆菌(ATCC25922)，金黄色葡萄菌(ATCC25923)(购于中国医学微生物保藏中心)。临床分离菌株：大肠杆菌LYG(江苏连云港)，大肠杆菌XX(河南新乡)，大肠杆菌NC(郑州南曹)，沙门氏菌S-XM(郑州新密)。
1.3.2 培养基
MH(A)琼脂培养基，MH(B)肉汤培养基(北京奥博星生物技术有限公司)。
1.4 试验方法
1.4.1 菌液的制备
菌悬液的制备：将细菌菌株接种于MH(B)肉汤培养基中，置37℃摇床中振摇培养过夜。通过麦氏标准比浊法对细菌菌液进行比浊计数，使用紫外可见分光光度仪在625nm波长处测定细菌菌液、麦氏标准管(0.5号管)的吸光度，用灭菌生理盐水调整细菌菌液的浊度达1.5×108cfu/mL(0.5号管)，备用。
1.4.2 体外抑菌试验--管碟法
向MH(A)琼脂平板培养基中加入200uL菌液，用灭菌L棒把菌液涂抹均匀，放置2min后放入灭菌牛津杯，每个平皿放4个，放置10min。黄连解毒散与白头翁散提取液各加2孔，同法制备的药液加在同一平皿上，细粉及超细微粉提取液各做4个重复。培养皿置37℃温箱培养16小时，游标卡尺测量抑菌圈直径大小。
2 数据处理与结果分析
采用统计学软件SPSS 13.0进行样本均数差异的显著性检验。
黄连解毒散、白头翁汤抑菌试验结果见表1，表2。黄连解毒散两种粉末经过水提、醇提后，抑菌圈大小存在显著差异(p<0.05)。但是，其对临床分离菌株XX、NC、沙门氏菌株S-XM未测定出抑菌效果。白头翁汤两种粉末经过水提、醇提后，除了大肠杆菌LYG外，对其它几个菌株抑菌圈大小也存在显著差异(p<0.05)。同时，其对临床分离菌株XX、NC未测定出抑菌效果。
表1 黄连解毒散抑菌试验结果（mm）
|
菌种 |
超微粉 |
|
细粉 |
|
水提液 |
醇提液 |
|
水提液 |
醇提液 |
|
金黄色葡萄球菌ATCC25923 |
10.01±0.240* |
11.59±0.472* |
|
9.118±0.279 |
10.07±0.216 |
|
大肠杆菌
ATCC25922 |
10.99±0.660* |
11.12±0.306* |
|
9.183±0.496 |
9.575±0.253 |
|
大肠杆菌LYG |
9.302±0.308* |
10.60±0.227* |
|
8.455±0.201 |
9.060±0.363 |
|
大肠杆菌XX |
— |
— |
|
— |
— |
|
大肠杆菌NC |
— |
— |
|
— |
— |
|
沙门氏菌S-XM |
— |
— |
|
— |
— |
注：*表示超微分与细粉水提液和醇提液的抑菌圈比较差异显著（p<0.05）；—表示未测出抑菌圈
表2 白头翁汤抑菌试验结果（mm）
|
菌种 |
超微粉 |
|
细粉 |
|
水提液 |
醇提液 |
|
水提液 |
醇提液 |
|
金黄色葡萄球菌ATCC25923 |
10.17±0.451* |
12.01±0.741* |
|
8.808±0.182 |
10.74±0.512 |
|
大肠杆菌
ATCC25922 |
11.57±0.772* |
11.15±0.395* |
|
8.980±0.496 |
9.928±0.279 |
|
大肠杆菌LYG |
10.31±0.324 |
10.65±0.559 |
|
9.404±0.354 |
9.856±0.343 |
|
大肠杆菌XX |
— |
— |
|
— |
— |
|
大肠杆菌NC |
— |
— |
|
— |
— |
|
沙门氏菌S-XM |
12.24±0.423* |
12.97±0.398* |
|
10.63±0.410 |
10.76±0.556 |
注：*表示超微分与细粉水提液和醇提液的抑菌圈比较差异显著（p<0.05）；—表示未测出抑菌圈
3 讨论
本次试验中，我们对黄连解毒散、白头翁汤超细微粉和细粉进行的体外抑菌试验结果表明，经两种不同方法提取后，其对大部分菌株的抑菌圈大小都存在着显著差异(P<0.05)。说明利用超微粉碎技术对中药方剂进行超微粉碎，可以大大提高有效成分的体外溶出度，使其体外抑菌效果明显提高，为其临床应用提供了科学依据。此外，我们也使用了临床分离的禽大肠杆菌和沙门氏菌菌株进行试验，除白头翁汤对沙门氏菌S-XM有抑菌作用外，上述两药对其它的临床分离菌抑菌效果都不佳。这与赵国荣[7]、祝国强[8]的研究结果基本一致，具体原因还需要在以后的研究中进一步探讨。
超微粉技术目前还主要应用于一些贵重药材及一些来源稀少、价格昂贵的保健滋补中药上，由于缺少严格的质量检测标准，因此还没有完全应用于市场。但是，中草药无论固体型剂或液体型剂在兽医临床中占着重要位置[9]。动物群体用药或饲料添加剂，大多数以散剂为主，使用方便、省时、省力、减少不良应激。尤其禽类饲用(投服)中草药散剂，因为没有咀嚼功能，肠道短，排泄快，药物进入胃肠未等溶出或溶出不全就被排出体外，当然降低效果，影响疗效。中药材经超微粉碎后，细胞破壁，中药有效成分的释放量大幅度提高，增加了其体外溶出度[10]。此外，在超微粉碎过程中，经控制可不产生过热现象，甚至可在低温下进行，并且粉碎速度快，有利于保留中药材中不耐高温的生物活性物质及各种营养成分，从而可大大提高药效，降低用药量，节约成本。
超微粉碎技术在中药生产上虽己显露出其特有的优势，但超微粉碎技术也不是万能的。研究表明，超微粉碎应用于中药的粉碎时，也存在一定的应用规律和应用条件等科学问题，而不是一个简单的粉碎过程。首先，并不是所有的药材都适合用采用超微粉碎，例如含淀粉、黏液质较多的药材，如果采用超微粉碎，细胞破壁高，这些无效成分也会因大量暴露而被释放出来，严重影响其他成分的释放并且可能阻碍有效成分的吸收[11]。含芳香性、挥发性成分的药材，破壁率高有利于有效成分的释放和吸收，但在粉碎的同时，挥发性物质的挥发损失也不容忽视[12]。本次试验结果，我们发现，上述两个复方中药提取液对某些细菌菌株在开始培养阶段能产生一定大小的抑菌圈，但在培养过一定时间后，牛津杯周围又开始有细菌生长，最后抑菌圈消失。我们怀疑可能就是药物粉碎后提取，其中的有效成分和无效成分都被释放，一些无效成分可能对细菌生长有促进作用，具体还需要在以后的工作用进一步探讨。其次，超微细粉的分级也是值得深入探讨的问题。目前大部分超微粉分出率较低，分级不及时导致细粉过多消耗大量机械能，使设备运行耗能大，导致整个系统效率低下，如何采用多级超微粉分级技术是实现超微粉精细分级和降低耗能的有效手段。中药经超微粉碎后，由于粒径的减小容易导致表面能增加，使颗粒处于不稳定状态;流动性差，易聚集形成假大颗粒;可湿性增加，易吸潮;吸附性增加，易吸附空气中的杂质，这些都不利于微粉中药及其制剂的过筛、保存、运输等。
为此，我们还需要进行超微粉碎的工艺流程、条件、生产设备等方面的研究，对于其中一些综合性强的技术问题，必须与其它技术或工程措施相结合，方能充分发挥超微粉碎的优势性，使其在兽药生产中得到广泛的应用。
|
