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口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的猪、牛、羊等多种偶蹄动物共患的一种急性、热性和高度接触性传染病。
口蹄疫具有传播距离长、传播速度快、流行范围广等特点，它属于世界性流行性传染病。
口蹄疫主要流行于非洲、中东地区和亚洲的一部分地区，一旦发生流行，不仅会给养殖行业带来极大威胁，而且会给其他行业及国家政治造成影响。
世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告的动物性传染病之一，我国将其列为必须上报的动物传染性疾病之一。
（图注：口蹄疫病毒）
口蹄疫病毒完整颗粒呈圆形或六角形正二十面体，每个衣壳由 60个相同的衣壳蛋白组成，每个衣壳蛋白均有VP4、VP2、VP3 和 VP1 四个结构蛋白构成，其中VP1 在病毒感染和宿主免疫机制方面起决定作用。由于口蹄疫病毒无囊膜，一些无机或有机溶液很容易进入病毒粒子内部，使病毒在溶液中具有一定的悬浮力。根据口蹄疫病毒完整颗粒和组装体在氯化铯溶液中浮密度不同，其沉降系数也有所不同。完整病毒粒子的沉降系数为 146S，无核酸的沉降系数为75S，由 VP0、VP1和 VP3各 5 个分子组成的沉降系数12S，由 VP0、VP1和 VP3各一分子组成的沉降系数为5S。
我国预防口蹄疫的主要手段是以口蹄疫疫苗免疫接种为主的综合防控措施，主要应用的疫苗是口蹄疫灭活疫苗和多肽疫苗，其中灭活疫苗应用更为广泛。由于全病毒颗粒含有完整的抗原表位，它能能够有效刺激机体产生抗体和致敏淋巴细胞，所以口蹄疫灭活疫苗146S含量是衡量口蹄疫疫苗质量的重要指标。根据146S的生化特性，现阶段可采用蔗糖密度梯度离心法、单克隆抗体夹心ELISA定量法、氯化铯密度梯度离心法、分子排阻色谱法、蛋白层析法、补体结合试验、放射免疫试验等方法测定口蹄疫抗原含量。本文通过口蹄疫疫苗抗原146S的生化特性介绍不同检测方法在实际生产的应用情况。
一、
根据蛋白质结构特性采用的检测方法
1.1 蛋白质的结构特性
蛋白质是一种由氨基酸构成的有机化合物。由于各个氨基酸残基的不同，以及在组装肽链时发生化学结构的变化，使其发生折叠或螺旋形成多样的空间结构，不同肽链再通过结合在一起形成稳定的蛋白质复合物，从而发挥特定的生化功能。因此，构成蛋白质的氨基酸种类、数目、排列顺序使其有了不同的空间构象。在口蹄疫疫苗的生产过程中，病毒液中会含有一些与口蹄疫免疫无关的杂蛋白，尽管随着生产工艺的提升，抗原浓缩回收率在不断提高，但还是不能完全去除杂蛋白。所以采用蔗糖密度梯度离心法、氯化铯密度梯度离心法、分子排阻色谱法等方法是根据不同蛋白分子大小及结构不同而设计的。
口蹄疫疫苗146S抗原作为一种蛋白复合物，它具有天然态和变性态两种属性。蛋白质的天然态主要由范德华力、静电作用、氢键及疏水作用来维持的，如果蛋白质一旦暴露于非生理环境中，在受到物理或化学压力时，蛋白质为了适应新的体系结构就会发生变化，这些结构的变化进而引起蛋白降解、可溶性聚集，以及不可溶性的沉淀等。所以，对口蹄疫疫苗146S抗原说，它在不同的环境中检测结果可能会存在很大差别，只有有效控制影响该物质稳定性的最大因素，才能设计出更合理的检测方法。
1.2检测方法的优缺点
此类方法能够使蛋白物质稳定存在于液态中，尽可能的减少其它物质对检测结果的影响，使其更具有独立性，保证其结构不受较大的影响；存在的缺点是过程繁琐，样品必须经过浓缩纯化，此过程会使抗原存在一定量的损失，人为操作也会影响检测结果。
二、
ELISA方法
酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，简写ELISA）是指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。
2.1抗原抗体反应特性
抗体能特异性的识别相应的抗原，并发生结合反应。抗原与抗体通过非共价结合，具有特异性、可逆性、比例性和阶段性的特性。这些特性将使抗原抗体结合反应更能表现出它的复杂性。因此抗原构象、浓度的变化及检测环境的变化都会影响ELISA的测定值。
2.2 检测方法的优缺点
ELISA的操作方法比较简单，其灵敏度高、特异性强，可以批量检测疫苗146S抗原含量，但是制备单克隆抗体成本昂贵，耗时久且过程比较复杂，不同毒株需制备不同的检测抗体。此类方法通过抗原特异性来进行疫苗质量监测，但不能有效区分完整颗粒、降解或聚集的颗粒，准确性难以控制。
三、
小结
现阶段，大部分企业主要应用蔗糖密度梯度离心法测定口蹄疫疫苗半成品及成品疫苗的有效抗原含量，也有个别企业结合应用单克隆抗体夹心ELISA定量法定量口蹄疫疫苗各型有效抗原含量。还有高效体积排阻色谱法作为一种疫苗抗原质量评价的新方法也被推广，但此方法需要解决好部分口蹄疫灭活病毒疫苗中杂质含量高、难以定量分析的问题。
蔗糖密度梯度离心是根据146S的说明，根据颗粒大小（沉降系数）来区分的，它不存在绝对的特异性，而抗ELISA所用到的抗体为亚型特异性空间构象型单抗，如病毒构象发生轻微的变化，都会影响到检测结果，并且体外抗原抗体结合反应受到浓度、温湿度、PH值等众多因素的影响。这说明两种方法建立的原理及所操作的环节区别较大，检测结果存在显著的差异，两者需要确立其它的参照依据或相关性来衡量口蹄疫疫苗的质量标准。
（作者：中农威特生物科技股份有限公司-杨儒爱）
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