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摘要：为了探究饲喂发酵饲料对妊娠母猪的产仔性能、肠道微生物发酵参数及微生物菌群组成的影响，选取经产母猪16头，随机分为2组，对照组饲喂常规饲料，试验组饲喂发酵饲料。试验从母猪妊娠85d开始，采集妊娠105d的母猪粪便用于发酵参数测定及高通量测序，记录母猪的产仔数和产活仔数和仔猪初生重。
结果:与对照组比较，饲喂发酵饲料显著提高了母猪粪便中乙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和戊酸的含量(P＜0.05)，但对产仔数、产活仔数及平均初生重无显著影响(P＞0.05)。微生物测序结果表明，2组菌群的多样性和结构存在相似性。在门水平上，饲喂发酵饲料显著降低了Fibrobacteres的相对丰度；在属水平，饲喂发酵饲料显著降低了Oscillospira和Fibrobacter属的相对丰度（P＜0.05)，对Blautia和Bacteroides相对丰度有提高的趋势(P＜0.1)。综上所述，饲喂发酵饲料可改变母猪肠道微生物菌群结构，促进后肠发酵，有助于改善母猪的肠道健康，但对母猪的产仔性能无显著影响。
猪肠道内栖息着大量微生物，这些微生物菌群的组成与结构直接影响到营养物质的消化吸收和宿主健康。在正常情况下，猪肠道微生物群落的组成相对恒定，但在其遇到日粮、疾病及温度的巨大变化时，猪消化道微生物群落的平衡会被打破，其生产性能也随之受到影响。研究发现，妊娠期母猪由于激素等内分泌因子的变化，常引发肠道微生物菌群结构紊乱，诱发便秘，对母猪生产性能造成极大负面影响。因此，如何改善妊娠母猪肠道微生物菌群结构与组成、防止便秘的发生，已成为当前研究热点。
材料与方法
1 试验设计
选取2～3胎次的妊娠85d左右的健康经产母猪16头，随机分为2组，每组8头，分别为常规饲料组(对照组)和发酵饲料组(试验组)。妊娠后期的日粮配方及营养水平见表1。发酵饲料的制作程序如下:采用保存于南京农业大学动物科技学院消化道微生物实验室的唾液乳杆菌L79、枯草芽孢杆菌B1121和酿酒酵母菌S1145制备菌液，并按质量比2∶2∶1进行混合(复合菌的总数量约为1×109cfu/g)，取对照组常规饲料，按2g/kg复合菌液添加于饲料底物中，调节饲料湿度为40%，混合均匀后分装至单通阀发酵袋中，于37℃发酵2d。基于2组所喂饲料的干物质量相同的基础上，饲喂前以6%的比例与常规饲料混合，将混合饲料作为试验组日粮。试验期间，每日饲喂2次，自由采食和饮水。试验期从妊娠85d开始。期间记录母猪的产仔数、活仔数和初生仔猪的重量。
2 粪样的采集与制备
在妊娠105d，采集各组的新鲜粪便样品，取部分粪样按质量比1∶1与去离子水混合，5000g离心10min后，部分上清液冻置于－20℃冰箱中，用于乳酸浓度的测定，另一部分上清液中以5∶1的比例加入25%(W/V)偏磷酸与巴豆酸混合液，混匀后冻存于－20℃冰箱中过夜用于挥发性脂肪酸浓度的测定；取部分样品于－20℃保存用于细菌DNA提取。
3 粪便样品中乳酸和挥发性脂肪酸的测定
乳酸含量采用乳酸测试盒(A019－2)测定。测定挥发性脂肪酸的样品解冻后，4 ℃、10000g离心10min，于GC－14B型气相色谱仪(Shimadzu)测定含量，具体方法参照相关文献。
4 粪便样品 DNA 的提取
粪便样品DNA采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit(Qiagen)提取。称取 0.25g粪便样品置于锆珠管中，与1mL Inhibit Ex缓冲液及0.1g锆珠 ( 直径1毫米 ) 混匀，采用MiniBeadbeater1(Biospec Products Inc)以4800r/min的速度混合20s，重复3次。将混合物于95℃的水浴锅中水浴5min。水浴后的混合物离心1min，取上清液置于新的1.5mL离心管中，并加入15μL蛋白酶K。测DNA浓度及纯度。
5 粪便微生物 Illumina MiSeq 测序
在Illumina(MiSeq)平台进行 DNA 双端测序。使用细菌16sRNA 基因的 V3 ～ V4 区作为模板，进行 PCR 扩增。
扩增条件为:95℃ 2min；95 ℃1min，55℃ 1min，72℃ 1min，25个循环；72℃ 5min。测序得到的序列通过QIIME(v.1.8.0)软件进行分析。将不含样品信息的序列、过短或过长的序列、出现ambiguous碱基及含有过多homologous碱基的序列去除。在97%的相似度水平上利用UPARSE对非重复序列进行OTU归类操作。利用稀疏曲线评价样品的覆盖率和取样深度；使用Alpha多样性指数:ACE、Chao、Shannon和Simpson进行单样本的多样性分析；利用未加权的PCoA计算样本间的差异性。
6 统计分析
试验所得数据经Excel(2010)初步处理后，常规数据采用SPSS20.0软件中的独立样本t检验方法进行分析，高通量测序结果采用Kruskal－Wallis进行非参数检验。显著性水平(P值)置于0.05。
结果与分析
1 母猪的生产性能
如表2所示，与对照组相比，饲喂发酵饲料对母猪的总产仔数、活仔数和平均初生重无显著影响(P＞0.05)。
2 母猪粪便样品的发酵参数
粪便的乳酸及挥发性脂肪酸的含量如表3所示。与对照组相比，饲喂发酵饲料对粪便中的乳酸和丙酸含量无显著影响(P＞0.05)。与对照组相比，饲喂发酵饲料显著提高了粪便中乙酸、丁酸、异丁酸、异戊酸和戊酸的含量(P＜0.05)。
3 母猪粪便微生物菌群的丰富度和多样性的变化稀疏曲线结果显示，各样品中的微生物的稀疏曲线趋于平缓，说明取样合理，测序深度足以反映检测样品的菌群多样性(图1A)。主坐标分析结果显示，2组样品无法明显区分开，说明2组间的微生物菌群存在一定的相似性(图1B)。如表4所示，与对照组相比，饲喂发酵饲料对母猪粪便微生物的OTU数、ACE、Chao指数、Shannon指数和Simpson指数均无显著影响(P＞0.05)。
4 母猪粪便细菌菌群组成的变化
在门水平上，粪便样品共检测到19个菌门。2组的优势菌门均为 Bacteroidetes、Firmicutes和Spiro-chaetae，占粪便细菌菌群组成的91%以上。如表5所示，与对照组相比，饲喂发酵饲料显著降低了Fi-brobacteres的相对丰度（P＜0.05)。在属水平上，共检测到262个属，其中有20个菌属的相对丰度大于1%。这20个属的分析结果在表6展示。与对照组相比，饲喂发酵饲料显著降低了Oscillospira和Fibrobacter的相对丰度(P＜0.05)，有提高Blautia和Bacteroides 相对丰度的趋势(P＜0.1)。
讨论
发酵饲料作为一类新型饲料，其在仔猪生产中得到广泛应用。研究发现，仔猪日粮中添加发酵饲料，可显著提高断奶仔猪的成活率和平均断奶重，降低哺乳仔猪的腹泻率，从而提高母猪的生产性能。但目前有关发酵饲料对母猪生产性能的影响的报道较少，本研究发现，饲喂发酵饲料对母猪产仔数、活仔数以及仔猪初生重无显著影响，结果说明母猪窝产仔数等生产性能指标更易受妊娠早期胚胎存活率的影响。猪肠道微生物主要栖息于消化道后段，胃和小肠未消化吸收的营养素进入后肠，经微生物发酵，产生大量发酵产物，进而可被机体吸收，发酵产物进入机体可起到供能及调控宿主代谢与免疫的作用。本试验中，饲喂发酵饲料显著提高了粪便中乙酸和丁酸的含量。在这些挥发性脂肪酸中，乙酸可作为肝脏和外周组织的能量来源，也可作为糖原异生和脂肪生成代谢途径中的信号分子。丁酸是结肠细胞的主要能量来源，可以预防炎症，同时其还可抑制肠道内的病原菌或腐败菌生长，促进益生菌的生长和增殖。有研究发现，丁酸在肠上皮细胞凋亡和增殖的调节中发挥重要作用。本研究表明，饲喂发酵饲料促进了母猪肠道微生物发酵，提高了粪便中挥发性脂肪酸的含量，因而对改善母猪肠道健康具有重要作用。
本研究发现，饲喂发酵饲料影响了母猪肠道微生物菌群的组成。与对照组比较，试验组母猪粪便中的Oscillospira和Fibrobacter属的微生物的相对丰度显著降低，Blautia和Bacteroides的相对丰度有升高的趋势。Blautia是结肠中存在的一种产乙酸菌，其丰度的升高与粪便中乙酸含量升高相一致。Bacteroides是肠道中普遍存在的一种菌，据报道，Bacteroides属微生物可以消化一些宿主难以消化的多糖，从而为机体供能。最近有研究表明，饲喂微生物发酵饲增加了断奶仔猪肠道菌群中的 Bacteroides属微生物的比例，该结果也与本试验的研究结果一致。Fibrobacter是一类纤维降解菌，其具有高纤维素分解活性，并且能够降解难降解的植物结构多糖。Fi-brobacter在试验组含量降低的原因分能是由于饲料经过益生菌发酵后，纤维素的含量降低，残留的纤维素被其他纤维降解菌分解所致。Oscillospira是结肠中一种常见菌，生长缓慢，有研究指出，这种缓慢生长关系着结肠的蠕动，并与便秘发生与否成正相关。本试验中，饲喂发酵饲料导致Oscillospira属微生物的丰度下降，暗示发酵饲料可能有利于降低母猪便秘的发生，从而有益于肠道健康。
结论
综上所述，饲喂发酵饲料可以平衡母猪肠道微生态，对肠道健康有益生作用，但对母猪的产仔性能未产生显著影响。
（参考文献略）
文章来源：畜牧与兽医,2019,51(5):29-33.
作者：张铮，宣海鹏，陆扬，毛胜勇
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