|
摘要 ：传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）新型变异株正在我国广泛蔓延，给商品 肉鸡群和蛋鸡群带来了新的威胁。本研究对一个疑似发生非典型传染性法氏囊病的地方品种雪山草鸡群进行了 RT-PCR 检测，并对分离的 3 株毒株进行了基因测序及序列分析。结果显示，引起该鸡群发病的病原是 IBDV 新 型变异株，属于 A2dB1 基因型 ；这 3 个毒株的 VP2 高变区编码蛋白上含有 IBDV 变异株的特征性氨基酸，也 具有 IBDV 新型变异株的独特氨基酸。结果提示，我国地方品种鸡群中也有 IBDV 新型变异株的流行，现有的 部分商品化 IBDV 疫苗已不能有效预防 IBDV 新型变异株的流行。
传染性法氏囊病（infectious bursal disease，IBD）是由传染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus，IBDV）引起雏鸡的一种急性、高度接触性、免疫抑制性传染病。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官法氏囊，导致其不同程度损伤，进而引起免疫抑制，造成疫苗免疫失败，严重威胁养禽业的健康发展。
IBDV的基因组为分节段的双链RNA，分为A、B两个节段，A节段长3 260 bp，包含两个部分重叠的开放阅读框架（open reading frame，ORF）。小ORF在前，编码VP5蛋白；大ORF在后，编码NH2-pVP2-VP4-VP3-COOH多聚蛋白。多聚蛋白被具有水解酶活性的VP4 蛋白水解为pVP2、VP4和VP3，之后pVP2 被进一步加工形成成熟的VP2。VP2蛋白是IBDV的衣壳蛋白和主要保护性抗原，其编码基因是IBDV最重要的毒力基因，也决定着IBDV的细胞嗜性。VP2蛋白高变区（第206~350位氨基酸）易发生突变，是A节段基因特征的代表区段，常被用于IBDV的遗传演化分析。B节段长2 827 bp，仅编码具有RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）活性的VP1蛋白。VP1蛋白与IBDV毒力和遗传演化也有重要关系。VP1蛋白第110~252位氨基酸序列被称为B-marker，是B节段基因特征的代表区段。
1957年，IBDV首次在美国特拉华州甘布罗镇被发现，随后演化出了经典毒株（classic IBDV，cIBDV）、变异毒株（variant IBDV，varIBDV）和超强毒株（very virulent IBDV，vvIBDV）。vvIBDV 和varIBDV于20世纪80年代末和90年代初在我国相继出现，且vvIBDV的高致死率给养禽业造成了巨大经济损失。随着饲养环境的改善和疫苗的广泛应用，vvIBDV的流行正在被有效控制。然而近年来，IBDV新型变异株在我国主要养禽地区广泛流行，在肉鸡群和蛋鸡群中都可检测到该毒株。最近，日本也发现了IBDV新型变异株的流行。由于缺乏抗原性完全匹配的疫苗，IBDV新型变异株流行范围仍在扩大，已成为养禽业健康发展的新威胁。本研究对地方品种雪山草鸡的某免疫鸡群进行了IBDV新型变异株的鉴定，以期为IBDV流行的综合防控提供参考。
材料及方法
材料
临床样品采集及处理 2020年9月，江苏省某鸡场的雪山草鸡出现疑似非典型IBD症状，发病鸡群为28日龄，发病鸡生长迟缓，剖检可见法氏囊明显萎缩，其他脏器未出现明显病变。该鸡群于1日龄免疫过vvIBDV疫苗。随机采集发病鸡法氏囊3份，剪取适量组织置于无菌EP管中，按1 g/mL的比例加入无菌PBS，于组织研磨器上充分研磨得到组织匀浆，反复冻融3次后于4 ℃ 5 000 g离心10 min，取上清用于后续检测。
方法
引物设计与合成 根据GenBank中的IBDV流行毒株参考序列，设计针对VP2基因高变区和VP1基因代表区段的特异性检测引物（表1），由北京擎科生物科技有限公司合成。
RT-PCR检测及VP2基因高变区扩增 取200 ?L上述法氏囊组织混悬液上清，依据RNAiso Plus产品说明书提取组织总RNA，使用M-MLV反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，利用针对IBDV VP2基因高变区的特异性引物P1/P2进行PCR扩增。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后，用1%琼脂糖电泳检测RT-PCR产物，预期扩增片段的长度为643 bp；然后对RT-PCR扩增产物进行测序，并将VP2高变区序列上传至GenBank。同时，以本实验室保存的IBDV弱毒株Gt株作为阳性对照，以去离子水为阴性对照。
VP1基因代表区扩增 以1.2.2中检测为阳性的样品cDNA为模板，利用针对IBDV VP1基因代表区段（B-marker）的特异性引物B293U/B1008L进行PCR扩增。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后，用1%琼脂糖电泳检测RT-PCR产物，预期扩增片段长度为716 bp；然后对RT-PCR扩增产物进行测序，并将B-marker序列上传至GenBank。同时，以本实验室保存的IBDV弱毒株Gt株作为阳性对照，以去离子水为阴性对照。
遗传演化分析 依据VP2基因高变区核苷酸序列和VP1基因B-marker核苷酸序列，运用序列分析软件Clustal X program（version 2.0）进行序列比对，使用软件MAGA6.0中的最大似然法构建进化树。相关参考毒株及其GenBank登录号见表2。
结果
RT-PCR检测
检测结果显示：本批样品的IBDV阳性率为100%（3/3）。VP2高变区引物扩增出与预期大小一致的目的条带，约为643 bp（图1-A）；VP1 B-marker引物扩增出与预期大小一致的目的条带，约为716 bp（图1-B）。将这3株IBDV分别命名为IBDV-JS20-9321、IBDV-JS20-9322和IBDV-JS20-9325。3株毒株VP2高变区序列和VP1 B-marker序列的GenBank 登录号分别为：IBDV-JS20-9321（MW328552/MW328555）、IBDV-JS20-9322（MW328553/MW328556）、IBDV-JS20-9325（MW328554/MW328557）。
遗传演化分析
VP2和VP1代表区段遗传进化树分析 依据IBDV基因型分型方法，基于VP2基因高变区核苷酸序列的遗传进化树分析结果显示，IBDV共分为9个基因型，血清I型包含A1—A8共8个基因型，其中A2基因型包括A2a、A2b、A2c和A2d共4个基因亚型。本试验鉴定的IBDV-JS20-9321株、IBDV-JS20-9322株和IBDV-JS20-9325株与IBDV新型变异株代表毒株SHG19均属于A2基因型中的A2d亚型（图2-A）。基于VP1基因B-marker的核苷酸序列进化树分析结果显示，IBDV共分为5个基因型，其中血清I型包含B1—B4共4个基因型，IBDV-JS20-9321株、IBDV-JS20-9322株和IBDV-JS20-9325株与SHG19均属于B1基因型（图2-B）。综合基因组双节段特征判定，本次鉴定的3株IBDV毒株与SHG19毒株处于同一分支，是IBDV新型变异株，为A2dB1基因型。
VP2和VP1代表区核苷酸同源性比对
VP2 VP2高变区的核苷酸序列同源性比对结果显示，IBDV-JS20-9321株、IBDV-JS20-9322株和IBDV-JS20-9325株与A2基因型IBDV毒株（变异株）的同源率较高，为89.6%~98.6%，其中与A2d基因亚型毒株（新型变异株）的同源性最高，为95.6%~98.6%。进一步比对发现，IBDV-JS20-9321株和IBDV-JS20-9325株与SHG19株的同源率均高达98.6%，IBDV-JS20-9322株与SHG19株的同源率高达98.2%。IBDV-JS20-9321株、IBDV-JS20-9322株和IBDV-JS20-9325株与变异株其他3个基因亚群A2a、A2b和A2c的同源率分别为94.3%~94.5%、93.1%~93.4%和89.6%~92.0%；与A1基因群（经典毒株）、A3基因群（超强毒株）和A8基因群（弱毒株）的同源率分别为89.4%~91.7%、88.0%~90.1%和90.8~91.7%；与血清I型其他4个基因群（A4、A5、A6和A7）毒株的同源率较低，为84.9%~89.8%。IBDV-JS20-9321和IBDV-JS20-9325的同源率为100%，其与IBDV-JS20-9322的同源率为98.6%。
VP1 基于VP1基因代表区段的核苷酸序列同源性比对结果显示，分离毒株（IBDV-JS20-9321株、IBDV-JS20-9322株和IBDV-JS20-9325株）与B1基因型IBDV毒株的同源率较高，为93.3%~98.8%，其中与IBDV新型变异株SHG19同源率最高，可达98.8%；而与B2基因型（超强毒株）、B3基因型（HLJ0504样毒株）以及B4基因型（过渡型毒株）同源率较低，分别为86.3%~86.5%、87.0%~89.1%和86.5%~87.4%。IBDV-JS20-9321株、IBDV-JS20-9322株和IBDV-JS20-9325株间的同源率为100%。
VP2高变区关键氨基酸比对 VP2高变区关键氨基酸比对结果（表3）显示，IBDV-JS20-9321株、IBDV-JS20-9322株和IBDV-JS20-9325株不仅具有A2 基因型毒株（变异株）共有的4个特征性氨基酸222T、249K、286I 和 318D，还具有A2d基因亚型毒株（新型变异株）的3个独特氨基酸221K、252I和299S。VP2高变区核苷酸比对结果显示，与A2dB1基因型（新型变异株）代表毒株SHG19相比，IBDV-JS20-9322株存在14个核苷酸突变，其中第1 076位的核苷酸突变引起了VP2蛋白的氨基酸突变（T359K）；IBDV-JS20-9321株和IBDV-JS20-9325株虽然存在11个核苷酸突变，但均为无义突变。VP1基因B-marker核苷酸比对结果显示，分离毒株（IBDV-JS20-9321株、IBDV-JS20-9322株和IBDV-JS20-9325株）与SHG19株相比存在5个无义核苷酸突变。
讨论
2017年以来，IBDV新型变异株在我国和日本主要养禽地区广泛流行。IBDV新型变异株虽然不能致鸡死亡，但在感染后3~5 d可导致中枢免疫器官法氏囊的急性损伤和免疫抑制，进而造成禽流感等疫苗免疫失败和继发感染以及增重等生产性能明显下滑。该毒株导致的亚临床IBD给养禽业造成了严重经济损失。IBDV新型变异株流行范围不断扩大，在肉鸡群和蛋鸡群中均有流行。雪山草鸡是我国优良的地方品种鸡之一。本研究在地方品种雪山草鸡群中检测到IBDV新型变异株，但该鸡群曾于1日龄免疫过用于防控vvIBDV感染的疫苗。研究发现，新近流行的IBDV新型变异株与vvIBDV抗原性不匹配是导致IBDV新型变异株免疫逃匿并蔓延的重要原因。
IBDV传统上分为经典株、变异株、超强毒株和弱毒株。这种描述性分类方法已经远远无法涵盖新出现毒株（包括IBDV新型变异株）的分子特征。最近，一种基于IBDV基因组双节段特征的IBDV基因型分类方法被提出：基于A节段编码的VP2高变区，IBDV可分为A1—A8以及AII等9个基因型；基于B节段编码的VP1 B-marker，IBDV可分为B1—B4以及BII等5个基因型；每个毒株可综合A、B的分子特征进行基因型分类。在该分型系统里，变异株被归类于A2B1基因型。该基因型又分为4个基因亚型，即A2aB1、A2bB1、A2cB1和A2dB1。遗传演化分析发现，本研究在雪山草鸡上鉴定的IBDV毒株（IBDV-JS20-9321株、IBDV-JS20-9322株和IBDV-JS20-9325株）与IBDV新型变异株代表毒株SHG19处于同一个分支，为A2dB1基因型。与早期在北美洲流行的变异株不同，这3个毒株的VP2高变区编码蛋白上含有IBDV变异株的特征性氨基酸，也具有IBDV新型变异株的独特氨基酸。氨基酸222T、249K、286I和318D已被证明与IBDV抗原变异密切相关，而氨基酸221K、252I和299S的生物学意义尚待进一步研究。
IBDV新型变异株在肉鸡、蛋鸡和地方品种鸡的免疫鸡群中不断蔓延，已经成为包括我国和日本在内的东亚地区养禽业的重要威胁，其遗传演化规律研究以及新疫苗的创制研究对IBDV流行的综合防控和养禽业健康发展具有重要意义。
|
