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猪杀菌性/通透性增强蛋白(BPI)的功能及其在抗病育种中应用的研究进展
戴超辉，董文华，吴嘉韵，包文斌，吴圣龙2
(1．扬州大学动物科学与技术学院，江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室，扬州225009；2．江苏省种猪繁育和健康养殖工程技术研究中心 ，扬州 225009)
摘要：杀菌性/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability-increasingprotein，BPI)有较强的杀菌作用(主要为革兰氏阴性菌)和中和脂多糖(lipopo1ysaccharide，LPS)的活性，以及增强单核细胞和嗜中性粒细胞对病原菌的吞噬功能。近年来，BPI的生物学功能受到广泛关注，被称为机体内的“超级抗生素”，BPI基因被很多学者作为抗病候选基因进行探索。作者综述了猪BPI基因的结构、生物学功能及其与猪抗性的关系等，阐述了BPI基因在猪抗病育种中的研究进展及应用前景，为下一步猪BPI基因的功能研究及其在抗病育种实践中的应用提供理论依据。
关键词：猪；杀菌性/通透性增强蛋白；抗病育种杀菌性/通透性增强蛋白(bactericidal/permeability increasing protein，BPI)最早在人的多形核中性粒细胞(poly-morphonuclear neutrophils，PMNs)的嗜天青颗粒中被发现的，属于脂质转移/脂多糖结合蛋白，是在中性粒细胞中发现的多种具有抗微生物活性的蛋白分子之一。随着研究的深入，发现BPI蛋白也存在于人嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、外周血单核细胞表面和皮肤、肠黏膜和生殖道上皮等部位。并在抵抗细菌(主要是革兰氏阴性菌)、真菌、原虫感染，免疫调节和抑制血管生成的过程中均发挥了重要的作用。周红等从猪中性粒细胞中提取纯化BPI，并对BPI的体内外作用进行研究，发现猪源BPI同样具有中和内毒素、杀灭革兰氏阴性菌的作用。鉴于BPI在机体内的广泛分布和重要的功能，其被称为机体内的“超级抗生素”，BPI基因被很多学者作为抗病候选基因进行探索和研究。因此，作者综述了猪BPI基因的结构、生物学功能及在猪抗病育种中的研究进展，旨在为猪BPI基因的功能研究及其在抗病育种实践中的应用提供理论依据。
1 猪BPI基因的分子克隆、结构特点及真核表达1.1 BPI基因的分子克隆
目前，人(GenBank登录号：NM_OO1725)、牛(GenBank登录号：NM_173895)、小鼠(GenBank登录号：NM_177850)和褐鼠(GenBank登录号：NM_001004079)的BPI基因cDNA序列已知，而猪(GenBank登录号：AF252874)的cDNA只有部分序列报道。在美国专利网中有一段关于猪BPI基因的10号序列信息，长1452bp，但并没有清楚的注释。袁树楷通过提取荣昌猪前腔静脉血总RNA，通过RT-PCR得到cDNA第一链；再根据同源性克隆方法，以及3’-和5’-cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNAends，RACE)技术，首次克隆出包含了编码区、3’-UTR和5’-UTR序列的荣昌猪BPI基因全长cDNA序列(GenBank登录号：EF436278)，并将其命名为FL-cDNA。魏麟等从黔邵花猪血液样品中提取总RNA并反转录成cDNA，通过将PCR产物切胶回收纯化后连接到克隆载体pMD18-T，最终筛选纯化后得到全长为1874 bp的BPI基因cDNA序列(GenBank登录号：FJ810853)，包含一个编码483个氨基酸残基的完整的开放阅读框。
1.2 BPI基因的结构特点
据美国专利网介绍，BPI基因10号序列多肽链具备与BPI/IBP/CETP超家族分子相同的N-末端结构功能区和C-末端结构功能区特征。袁树楷通过对克隆的荣昌猪BPI基因进行氨基酸性质分析及蛋白结构预测分析，发现猪源BPI蛋白是一个阳离子蛋白，主要包含基本二级结构单元α螺旋和延伸主链，三级结构则和人源BPI三位晶体结构相似，呈飞棒型。多肽链21-356位具备典型的BPI/IBP/CETP超家族分子N-末端结构功能区，280-480位具备典型的该超家族分子C-末端结构功能区特征，与人的BPI蛋白同源性较高。魏麟等对黔邵花猪的BPI基因也进行了克隆和生物学信息分析，通过比较不同物种BPI蛋白的同源性发现，黔邵花猪BP1分子结构与人等哺乳动物同源性较高，也具有2个功能结构域和超活性结构域，并存在胰蛋白酶水解位点(LVAPPR)，可使BPI蛋白裂解为氨基部分和羧基部分。吴正常等通过对苏太猪BPI蛋白结构和功能进行预测分析发现，猪BPI蛋白的基本理化性质与人BPI基本相同，二级结构和三级结构也与人相似。随后，吴正常等利用生物信息学分析了13个物种的29条BPI基因cDS序列，发现BPI蛋白主要二级结构元件为a螺旋、l3折叠和无规则卷曲，有2个保守结构域(BPI 1和BPI 2)，BPI基因具有较强的密码子偏爱性。上述研究表明BPI基因在不同生物种类中较高的保守性，提示BPI基因在生物体内具有极其重要的功能。
1.3BPI基因的真核表达
原核表达和真核表达是重组蛋白质的主要表达系统，前者主要是大肠杆菌，后者则常用酵母和哺乳动物表达系统等。目前发现在大肠杆菌中很难检测到BPI重组蛋白，并且检测到的重组蛋白主要以包涵体形式存在，不具有生物活性，所以相对而言，猪源BPI蛋白的真核表达更具有研究和实践意义。殷学梅等成功构建了猪源BPI蛋白真核表达载体pUC57-BPI，进一步利用SDS-PAGE和Western blotting方法在293-6E细胞培养上清中检测到猪源BPI重组蛋白的表达，证实了利用真核表达系统可以成功获得猪源BPI重组蛋白。该猪源BPI重组蛋白体外表达系统的建立为今后深入研究猪BPI的生物学功能及猪抗菌蛋白的制备奠定了试验基础。
2 猪源BPI蛋白生物学功能
2.1BPI的杀菌作用
BPI的杀菌活性主要针对革兰氏阴性菌(大肠杆菌属、沙门菌属、志贺菌属、假单胞菌属、志雷伯菌属、变形杆菌属、沙雷菌属及奈瑟菌属等临床致病菌)，而对革兰阳性菌和哺乳细胞无活性。但Domingues等发现，重组杀菌性高通透性蛋白rBPI 21对革兰氏阳性菌——金黄色葡萄球菌也有活性作用，能够诱发其细菌膜去极化，改变其表面膜电位，导致细菌正常生理结构改变而死亡。关于猪BPI蛋白，周红等在研究猪BPI蛋白体内外生物活性后发现，猪源BPI蛋白具有很强的杀灭革兰氏阴性菌作用，另外还能增加革兰氏阴性菌外膜通透性，并且BPI的杀菌活性与通透性增加能力紧密相关。
一般认为，BPI的杀菌机制为当外界病原菌进入动物机体后，BPI先与革兰氏阴性菌外膜脂多糖的内核和类脂A区域初步结合，然后与类脂A的疏水区域发生作用。BPI对革兰氏阴性菌的杀菌作用过程主要包括两个阶段：初始时，BPI与细菌外膜相应部位结合后就可迅速抑制细菌生长，但是在血清蛋白浓度升高时，细菌可以修复早期损伤，并能继续生长；随着时间延长和细菌持续暴露于BPI作用下，细菌胞质膜上影响其能量代谢的部位发生结构和生理上的改变，最终导致细菌死亡。
2.2 BPI的中和内毒素作用
内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)，在菌体裂解后释放进入血液中，通过作用于机体内的单核吞噬细胞，诱导细胞分泌多种炎性介质分子引起局部或全身病理反应。BPI可以结合各种游离的LPS，LPS与BPI结合后不能被巨噬细胞LPS受体复合物识别，从而对LPS诱发的炎症反应(TNF和IL-1等促炎细胞因子)起到显著的抑制作用。周红等研究发现，猪BPI可阻止肝内枯否氏细胞LPS诱导TNF-α的分泌，在体外阻断LPS引起的炎症因子的释放，即猪BPI蛋白和人BPI一样，均具有中和内毒素的生物学功能。而后研究发现，抗人BPI多抗或单抗不仅能增加猪BPI的杀菌活性，而且能增加其结合内毒素的活性。
2.3 BPI结合LPS作用
BPI不仅能够结合各种游离的LPS来中和动物体内的内毒素从而抑制炎症反应，还能高亲和地结合菌体上的LPS。有研究报道，BPI及其活性片段是目前已知的结合内毒素能力最强的物质，BP不仅能直接与革兰氏阴性菌胞膜上的LPS结合而杀灭细菌，与LPS结合后还可竞争性地抑制LPS与同家族的脂多糖结合蛋白(1ipopo1ysaccharide binding protein，LBP)的结合，从而抑制LPS诱导的级联反应。BPI与LPS的亲和力比LBP与LPS的亲和力高50～70倍，所以较低浓度BPI就可以竞争性抑制较高浓度LBP与LPS的结合，减少LPS-LBP复合物的形成，抑制LPS介导的细胞因子的释放，最终抑制LPS诱导的一系列炎症反应。有试验发现，动物机体受到革兰氏阴性菌感染后，BPI的表达明显升高，且BPI/LBP值也升高，这有利于BPI同LBP竞争性结合内毒素，减少内毒素引起的局部和全身性炎症反应及毒性作用。
3 BPI在猪抗病育种中的作用
猪病频发是当前中国生猪产业面临的重大问题，给养猪业带来了严重的经济损失。随着国内外对猪病研究的进一步深入，单纯依靠防疫和药物治疗已无法彻底防控猪病；从长远来看，采用遗传学方法从遗传本质上提高猪的抗病力，开展抗病育种具有治本的功效。鉴于BPI基因的重要生物学功能，其作为猪抗病育种的重要候选基因已受到广泛关注。
3.1 猪BPI基因的多态性与疾病抗性关系
史宪伟等研究表明，约克夏猪、梅山猪、PIC猪等的BPI基因外显子4多态性丰富，且与猪抗沙门氏菌的抵抗力有关。Tuggle等在约克猪、汉普夏猪、杜洛克猪、长白猪、大白猪、野猪和梅山猪中检测到BPI基因外显子4和10分别存在AvaⅡ和HpaⅡ酶切多态性，而且发现其基因型与猪沙门氏菌的易感性有关，并把BPI基因确立为抗病育种候选基因。朱琛等采用PCR-RFLP方法对亚洲野猪、梅山猪等l1个猪群体的BPI基因第10外显子HpaⅡ酶切位点多态性进行分析，发现不同猪群体间BPI基因多态性上存在一些差异，但与体型、生产类型及地理分布等因素没有显著联系，并基于试验结果初步推测，BPI基因AA基因型可能具有较高的免疫应答能力。Liu等进一步确认了BPI基因第10外显子HpaⅡ酶切位点的多态性与苏太仔猪对大肠杆菌F18的抗性显著相关，并揭示AA基因型很可能是仔猪抵抗大肠杆菌F18侵染的一个潜在分子标记。袁树楷等研究发现,荣昌猪BPI基因外显子3存在一个新的SNP位点，即第397位核苷酸发生G-A的突变，引起第101位氨基酸由Arg替换为Gin，在测试的荣昌猪群体中该位点只检测出GG型和AA型2种基因型，且等位基因G为该位点的优势基因，并推测是因为该位点出现带正电荷的氨基酸Arg，更有利于增强BPI蛋白依赖于强静电作用的杀菌和中和内毒素活性。
3.2 猪BPI基因的表达与疾病抗性关系
分析探讨猪源BPI基因的表达和革兰氏阴性菌疾病或一般抗病力的关系，对将其作为猪抗病育种候选基因的功能验证具有重要的理论价值和实践意义。叶兰等以前期已建立的苏太猪F18大肠杆菌病抗性和敏感性资源家系群体为试验材料，分别选择大肠杆菌F18菌株抗性和敏感性断奶仔猪，检测BPI基因在断奶仔猪各个组织中mRNA的表达情况，并比较其在大肠杆菌F18菌株抗性型和敏感型断奶仔猪个体间的差异表达水平。结果显示，BPI基因在猪的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肌肉、胸腺、淋巴结中几乎不表达或表达量很低，而在十二指肠和空肠中表达量很高；并且在十二指肠和空肠中，BPI基因在抗性组的表达量均显著高于敏感组，提示BPI基因对断奶仔猪肠道中大肠杆菌F18菌株的感染可能具有直接作用，并且断奶仔猪对大肠杆菌F18菌株的抗性可能与BPI基因在肠道中表达量上调有关。之后又有研究检测了BPI基因第10外显子酶切位点不同基因型在F18菌株抗性型和敏感型断奶仔猪个体中的十二指肠和空肠的mRNA表达水平和蛋白翻译水平，发现抗性型个体肠道组织中BPI基因的mRNA表达水平明显高于敏感型个体，再次验证了AA基因型的BPI基因高表达和抗病性密切相关。Zhu等通过检测不同日龄(8、18、30和35日龄)苏太猪的十二指肠和空肠的BPI基因mRNA表达水平，分析不同日龄间BPI基因mRNA表达水平的差异显著性，发现空肠中BPI基因mRNA表达水平只在18和35日龄有显著差异，而十二指肠中BPI基因mRNA表达水平在35日龄时有显著差异，由此推测猪BPI基因可能是断奶仔猪抵抗F18大肠杆菌侵袭的直接因素，并且BPI基因的mRNA的表达上调和断奶仔猪F18大肠杆菌的抗病性有直接关系。
3.3 猪BPI基因的表观遗传修饰与疾病抗性的关系表观遗传修饰(epigenetic modification)主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰及非编码RNA(non-codingRNA)等，介导炎症性肠病的易感性基因与机体内、外环境间的相互影响，在炎症性肠病的始发及其疾病持续发展的过程中起着重要的作用。其中，DNA甲基化是一种非常重要的表观遗传学标记，其能影响染色质结构和基因转录效率，对脊椎动物维持正常的胚胎发育必不可少。目前关于人和其他动物的BPI基因甲基化鲜有报道，因此探讨猪BPI基因甲基化影响转录和表达进而调控猪对炎症等疾病的抗性和易感性显得非常重要。Wang等通过检测苏太猪BPI基因上游CpG岛的甲基化状态并结合从出生到断奶的苏太仔猪十二指肠中BPI mRNA表达水平发现，BPI基因上游CpG岛有许多潜在的转录因子结合位点，共发现10个CpG位点，并且每一个CpG位点都发生了甲基化；关联分析显示BPI基因CpG岛的甲基化与BPI mRNA的表达呈负相关，表明BPI基因通过上游CpG岛的脱甲基化来提高BPI基因的mRNA表达水平，进而发挥其杀菌等抗炎作用。
4 结语
关于猪的抗病育种研究，国内外学者都进行了积极探索，并取得许多重要的成果。目前研究猪抗病育种的方法主要集中在候选基因法、基因组扫描、转录组分析等。其中候选基因法是开展最早也是应用最多的分子水平抗病育种研究方法，在研究以BPI基因为代表的候选基因在猪机体抵御病原微生物感染等外界不良刺激时起到了重要的作用。而BPI蛋白具有非特异性杀伤革兰氏阴性菌、中和内毒素、免疫调理等功能，是一种重要的抗病分子标记。随着现代分子生物学技术的迅猛发展，国内外学者们对BPI的功能研究方法也越来越多，包括分子水平、组织表达水平、细胞水平甚至转基因动物模型的制备等。虽然目前关于BPI基因在猪抗病育种上的大部分研究还未能实际应用和产生经济效益，但是随着对猪BPI基因功能及调控机制的深入研究，将会在猪抗病育种实践中更加凸显其应用前景。
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