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猪体细胞克隆和基因编辑技术研究
张展1，刘芳1，陈淑慧2
（1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东 佛山 528000；2.佛山科学技术学院马克思主义学院，广东 佛山 528000）
体细胞核移植（SCNT）是一种将已分化的细胞重编程恢复其全能性，进而生产与供体细胞基因型完全相同后代的无性繁殖技术。包括收集并成熟卵母细胞，供体细胞核处理，重构胚的体外激活，胚胎的培养和移植等过程。猪的SCNT技术的建立在农业和医学有广泛的应用。
基因编辑技术（Geneediting technology）是指利用基因工程的基本原理对动物基因组的靶向基因进行有目的的编码修饰，并结合体细胞克隆和胚胎移植等技术手段，获得经过基因修饰的个体且可稳定遗传给子代的一种生物技术。此技术不仅克服了大型动物在传统育种方面存在的周期长、遗传效力低等问题，而且在抗病性、肉质改善、动物福利及动物疾病模型等研究上都有重要突破。CRISPR/Cas9系统是目前应用最广泛的基因编辑技术。文章将对猪体细胞克隆技术进行概述，从影响其效率的因素应用以及同基因编辑的联系等方面进行综述。
猪SCNT概述
关于克隆猪的发展早期开始于1989年，当时的研究者将减数分裂中期的卵母细胞中形成的致密morula或blastocys:stage共88个核移植胚胎移植到受体中继续发育，1头小猪出生。研究表明，细胞核在转移到去核的、激活的减数分裂中期的卵母细胞后能够直接发育到足月。猪的体细胞核移植技术发展较为缓慢。美国研究员Polejaeva2000年研究并报道了从培养的成年体细胞群中克隆出仔猪。国内方面，东北农业大学于1999年成功获得体细胞克隆猪囊胚，直至2005年我国第1头体细胞克隆猪诞生，其在国内克隆技术发展历程上具有里程碑意义。近年来猪的体细胞核移植技术逐渐完善，国内越来越多的研发机构通过体细胞克隆获得仔猪，比如，广西特色小型猪、巴中土猪、太湖猪等。
供体细胞的影响
在体细胞克隆研究中，已经发现通过胎儿成纤维细胞、肾脏细胞、心脏细胞、颗粒细胞、成年猪皮肤成纤维细胞等成功得到了克隆猪，但是不同的供体细胞来源对体细胞克隆的效率有一定影响。潘登科等人利用胎儿成纤维细胞、成年猪耳成纤维细胞和颗粒细胞进行细胞核移植，结果表明，使用胎儿成纤维细胞和颗粒细胞作为核供体的重构胚融合率（72.7%vs.81.5%）与耳成纤维细胞的对应结果差异显著（62.8%）；Li，Z等以3种类型的供体成纤维细胞在克隆猪的大规模生产中进行了测试，结果表明使用胎儿的成纤维细胞可以显著提高克隆胚胎的妊娠率和分娩率。Tianbin Liu等研究结果表明胎儿成纤维细胞导致重构胚胎率较低（30.38%比37.94%、34.65%和34.87%），但总体效率更高。Z.Hua等利用梅山猪胎儿成纤维细胞成功克隆了克隆猪，其克隆效率优于初生仔猪和成年猪成纤维细胞，表明核供体细胞系对梅山猪克隆胚胎的发育能力和克隆效率均有显著影响。从以上研究结果不难看出，在克隆猪方面，虽然有多种细胞形态可以作为供体细胞进行克隆，但是最为理想的供体细胞仍然是胎儿成纤维细胞。
受体细胞的影响
通过体外采集到的卵母细胞对猪SCNT的影响主要表现在其成熟后卵母细胞的品质，在实验研究中通常采用体外培养成熟和体内自然发育成熟的卵母细胞。理论上讲，自然发育成熟的卵母细胞要比体外培养成熟的卵母细胞更为理想，但是体内发育成熟的卵母细胞难以获取且价格昂贵；体外培养成熟的卵母细胞虽然价格便宜、易获取，但是移植效率低。有研究表明，以体内和体外成熟卵母细胞作为核移植受体构建的克隆胚胎二者的胚胎融合率和卵裂率均无显著差异，但体内成熟卵母细胞囊胚率高于体外成熟卵母细胞。然而，在临床试验或者实际应用中仍然以体外成熟的卵母细胞作为核移植受体的主要来源。在克隆猪方面，有研究表明卵丘细胞会影响卵母细胞内的谷胱甘肽合成，影响卵母细胞成熟后的品质。
此外，猪卵母细胞成熟的又一影响因素是卵泡液的成分。根据不同质量的卵母细胞制订最优的体外成熟方案，有助于获得较高的成熟率。有实验研究表明黄芩苷可以通过抑制促凋亡相关基因（Bax）mRNA，提高卵母细胞体外成熟能力和质量。用甲基-β环糊精（CLC）预处理可以提高猪卵母细胞的存活率和成熟率。Ji Eun Park等发现软性琼脂糖基质能有效抑制卵母细胞和胚胎的凋亡。
胚胎移植数量和方法
对SCNT效率的影响
胚胎移植技术是影响克隆猪生产效率的诸多因素中最为重要的因素之一。进行核移植后的重构胚，融合激活，在体外培养后通过腹腔镜微创手术、开腹手术或非手术方法等移植到代孕母猪的子宫内，发育成为个体。肷窝部开腹手术的方法是目前应用最多的猪胚胎移植方法，其易于学习操作简单，但是开腹手术可能导致肠壁、腹膜等粘连的风险，且在手术中应考虑的诸多因素，比如麻醉、术后护理等都会对胚胎移植的效果造成影响，不利于代孕母猪的再次利用。2014年有研究对手术法胚胎移植进行优化，在一定程度上提高了克隆效果。
猪是多胎动物，每窝怀孕3～5胎以上才能够维持妊娠，所以胚胎移植数目对克隆的效率起到一定的决定作用，有研究表明将过量的（250～450个）克隆胚胎移植到个体代孕者身上对提高效率并无作用，移植到个体受体上的重构胚胎的最优数量为200～249个。
基因编辑和猪SCNT的应用
理论上讲，基因编辑技术和转基因技术是不同的。近年来，转基因技术特指将外源基因转入到受体生物中的技术，而狭义的基因编辑则相对地特指转基因之外的对生物体基因组目标基因的特定修饰。
猪体细胞克隆技术首先可用于畜牧业，作为一种方便、有效的方法来提高种群的质量，加速遗传改良；同时保护濒危灭绝物种是体细胞克隆的另一个潜在应用。为了达到高质量猪肉蛋白供应，可通过基因编辑和SCNT技术相结合培育满足理想生产性能的猪，提高猪的抗病能力，改善猪肉营养价值和猪肉生产，例如：抗猪蓝耳病的基因编辑克隆猪、增加对非洲猪瘟抗性克隆猪等。
其次，猪的SCNT技术和基因编辑技术相结合在医学领域也有广泛的应用，随着以CRISPR/Cas9为主的多种CRISPR系统的不断研发和改进，基因编辑技术逐渐完善，对人类疾病动物模型的制备有重要意义。自20世纪80年代中期引进慢性免疫抑制药物以来，临床移植已成为终末期器官衰竭的首选治疗方法之一。解决人体器官供应有限问题的一种新方法是利用替代物种作为器官来源。出于对伦理、繁殖特性、传染病、解剖结构以及生理功能的考虑，并且小型猪在外科操作上更加便利，猪被认为是主要的替代物种。通过基因编辑获得克隆猪的心、肾等器官，可以使异物种器官移植后随之而来的超急性排斥反应大大降低。
小结
自2000年第1头体细胞克隆猪诞生以来，虽然体细胞克隆技术不断更新、发展，相关理论研究和技术优化也取得长足进展，但是目前该技术相关机制仍不明确，生产效率低，新生仔猪会仍出现器官发育异常、呼吸困难、骨骼发育不完善等先天性疾病。造成这些情况的原因有很多，例如文中所述，但普遍认为是表观遗传学重编程不完全或异常造成。相信随着SCNT技术的不断深入研究、完善，并且随着新的基因编辑技术的不断创新，促进基因修饰猪的研究新发展，广泛应用于猪的精准育种以及生物医学领域，并取得一定的成果。
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