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背景
禽传染性支气管炎（IB）是由IB病毒（IBV）引起的一种传染性极强的急性病毒性呼吸道疾病，主要感染鸡。作为一种呼吸道疾病病毒，IBV 最初以支气管上皮为目标，并诱发急性呼吸道症状，如气管啰音和呼吸困难 。一些菌株还可以传播到泌尿生殖系统，导致严重的肾炎，降低蛋鸡的产蛋量和质量。此外，受感染的鸡还容易受到支原体、细菌或其他病原体的继发感染，导致死亡率增加。
在我国，QX型IBV于1997年在山东青岛首次报道从患有腺胃炎的肉鸡群中分离得到，近二十年来，周边多个国家和地区也出现了暴发。世界上，并逐渐发展成为许多地区的流行基因型。
QX型IBV对多个器官具有高致病性，可引起严重的气管纤毛损伤，显著肿胀苍白的肾脏，输卵管和卵泡发育异常。
受感染的鸡通常在输卵管中表现出特征性的扩张和血清样液体积聚，称为囊性输卵管。产蛋期间，受感染鸡的卵巢虽然发育正常，但卵黄会落入腹腔，因输卵管退化关闭而引起腹膜炎。
在本课程中会出现一种称为“假层”综合症的情况。生殖疾病的严重程度因病毒株、感染期和个体宿主条件而异 。属于 QX 型的不同菌株在致病性上也表现出显著差异 。
尽管已知 QX 型 IBV 会对幼鸡的输卵管造成严重损害并随后破坏产蛋，但在产蛋期发生感染时对输卵管的致病性仍不清楚。此外，输卵管在形态上分为四个不同的功能段，包括漏斗部、枕大部、峡部和子宫。蛋白、蛋壳膜和蛋壳分别在枕骨大部、峡部和子宫中形成 。蛋壳膜呈纤维网状结构，主要由胶原蛋白和糖蛋白组成。I 型和 V 型胶原蛋白存在于蛋壳膜中，它们的比例约为 100:1 。在禽蛋壳腺中，钙结合蛋白 (calbindin, CaBP) 以 28 kDa 的高分子量蛋白 (CaBP-D28k) 的形式存在，并在 Ca 2+的运输中发挥作用以形成蛋壳 。因此，有必要研究QX型IBV对输卵管不同节段的影响。
本研究的目的是更好地了解 IBV 的致病性。为此，采用 QX 型菌株 QXL 和 Mass 型菌株 M41（主要引起呼吸道症状）对输卵管不同节段的致病性进行调查和比较。通过检查抗原分布、病变和促炎细胞因子、细胞毒性分子、I 型干扰素和蛋壳形成相关基因的表达来评估病理变化。
材料和方法
动物
SPF 含胚鸡蛋购自北京勃林格殷格翰生命生物技术有限公司（中国北京）。SPF 白色来亨鸡购自济南四牌福瑞畜牧科技有限公司（中国山东）。
病毒
QX 型 IBV 毒株 CK/CH/JS/2010/12（缩写：QXL）于 2010 年从表现出呼吸系统症状和死亡的肉鸡的气管和肾脏中分离出来 [。质量型 IBV M41 株购自中国兽医培养物保藏中心（CVCC AV1511）。将QXL和M41菌株系列稀释（10 –1 –10 –8），将每个稀释度的5个重复样品接种到10日龄SPF鸡胚中，计算50％鸡胚感染剂量（EID 50）使用 Reed 和 Muench 的方法。
实验设计
共有 18 只来亨白鸡被饲养在负压隔离器中，光照 12 小时，并提供足量的食物和水，直到它们达到 300 日龄。然后将他们随机分成三组，两个挑战组和一个对照组（每组 n = 6）。两个攻击组的鸡通过眼鼻途径接种 200 μL 含有 10 4 EID 50的尿囊液IBV 菌株 QXL 和 M41，每个菌株一组。对照组的鸟通过眼鼻途径给予200μL盐水溶液。在接种后第4天和第8天，从每组中随机选择三只动物并通过颈椎脱臼进行安乐死，以评估输卵管的宏观病变。来自漏斗部相同区域的组织样本，大酒瓶，每只鸡的峡部和子宫被收集（附加文件1）。
组织病理学和免疫组织化学
输卵管的四段固定在 10% 中性缓冲福尔马林中，通过标准组织学程序处理，包埋在石蜡中，并切成 4 μm 切片。一些石蜡切片用汉森苏木精和伊红染色用于组织学观察，而另一些切片则用于免疫组织化学 (IHC) 以检测病毒抗原的强度。简而言之，将切片与 10% (v/v) 山羊血清（封闭溶液）一起孵育 30 分钟。然后将它们与 1:15,000 稀释的小鼠 IBV N 蛋白单克隆抗体在 37 ℃ 下孵育 2 小时 。用 PBS（3 × 5 分钟）清洗切片后，使用浓缩的 SABC-POD（小鼠 IgG）试剂盒（BOSTER Bioengineering Co. Ltd.，目录 #SA2001）检测免疫反应产物。使用 DAB 对切片进行可视化，并用 Hansen's 苏木精复染。使用光学显微镜（Leica，Wetzlar，Germany）观察所有切片。
RT-qPCR分析与免疫反应和蛋壳形成相关的基因表达使用 Ultrapure RNA 试剂盒（CoWin Biosciences Co. Ltd.，目录 #CW0581M）提取来自输卵管不同节段的总 RNA（每个节段 100 mg 组织）。使用超微量样品分光光度计 (Thermo, USA) 测量每个样品中的 RNA 浓度，然后使用 EasyScript? Reverse Transcriptase (M-MLV, RNaseH-) Kit (TransGen Biotech Co. Ltd) 逆转录 1 μg RNA ., 目录 #N10227) 和 Oligo (dT) 18（Takara Bio，目录 #3806）根据制造商的说明。反应在 42°C 下进行 30 分钟，在 85°C 下进行 5 秒以合成 cDNA。RT-qPCR 混合物由 10 μL AceQ? qPCR SYBR Green Master Mix（Vazyme Biotech Co. Ltd.，目录 #Q111-02/03）、0.4 μL 正向引物、0.4 μL 反向引物、7.2 μL 核酸酶组成- 无水和 2 μL cDNA（或用于对照的无核酸酶水）。RT-qPCR 的热曲线为 95 °C 5 分钟，然后是 95 °C 10 秒、60 °C 30 秒、95 °C 15 秒、60 °C 60 秒和 40 个循环使用 LineGene 9600 Plus（Bioer Technology Co. Ltd.，杭州，中国）在 95 °C 下保持 15 秒。用于 RT-qPCR 的引物先前已描述 [。目标基因表示为相对于 RPS17 看家基因的比率，并使用 2 -ΔΔCT方法 计算值。
统计分析
GraphPad Prism 8.3 软件（GraphPad，La Jolla，CA，USA）用于通过单向方差分析分析所有统计数据。当 P 值 < 0.05 时，攻击组和对照组之间的差异被认为具有统计学意义，在P < 0.01 时高度显著，在P ?< 0.0001?时非常显著。
结果
组织病理学和免疫组织化学
为了评估病毒抗原在输卵管不同节段中的分布，石蜡切片用 IHC 方法染色。IHC结果显示，在黏膜上皮纤毛和固有层中广泛检测到QXL株抗原的存在（图 1 A2、B2、C2、D2），而M41株抗原主要在黏膜上皮中检测到。纤毛（图 1 A3、B3、C3、D3）。QXL株抗原在峡部的分布比在输卵管其他节段更分散（图1C2 ）。QXL组在枕骨大部、峡部和子宫的综合光密度（IOD）显著高于M41组（图 1E）。
感染后 4 天对 QX 和 Mass 型 IBV 抗原进行免疫组织化学检测。A1-D1对照组输卵管不同节段。A2-D2 QXL 组不同的输卵管节段。A3-D3 M41 组不同的输卵管节段。E输卵管不同节段的 IOD 总和。* P ?< 0.05，** P ?< 0.01，*** P ?< 0.001 代表 QXL 组和 M41 组之间的显著差异。黑色箭头表示抗原沉积。比例尺：50 或 100 μm。E、黏膜上皮；LP，固有层采用HE染色法评价输卵管不同节段的病理变化。在对照组中，漏斗部、枕骨大部、峡部和子宫的黏膜上皮被纤毛状假复层上皮覆盖，固有层充满管状腺体（图 2 A1、B1、C1、D1）。在 QXL 组中，许多淋巴细胞已浸润到固有层的结缔组织中（图 2 A2、C2），而在 M41 组中很少观察到炎症细胞。QXL组漏斗部和大区管状腺体明显扩张（图2A2、 B2） ，而M41组峡部和子宫上皮细胞脱落（图 2 ）C3，D2）。此外，由于 QXL 组子宫固有层间质扩张，管状腺体的密度降低（图 2 D2）。
感染后4天输卵管中QX和Mass型IBV致病性的组织病理学分析。A1-D1对照组输卵管不同节段。A2 QXL组漏斗部，黑色箭头表示巨噬细胞和淋巴细胞分布于固有层结缔组织中，白色箭头表示管状腺体扩张。QXL组的B2 Magnum，白色箭头表示管状腺体的扩张。QXL组的C2峡部，黑色箭头表示淋巴细胞浸润固有层间质。QXL组的D2子宫，白色箭头表示间质扩张。C3M41组峡部，白色箭头表示上皮细胞脱落。M41组D3子宫，白色箭头表示上皮细胞脱落。比例尺：50 μm。E、黏膜上皮；L，流明；LP，固有层促炎细胞因子基因和细胞毒免疫反应相关基因表达的变化为了评估输卵管各节段的炎症程度，在感染后 4 天和 8 天检测促炎细胞因子（IL-6、IL-1β、IFN-γ 和 IL-2）的表达。感染后 4 d 峡部和子宫 4 d 和 8 d IL-6 的表达在 QXL 组显著高于对照组，而在 QXL 和 M41 组的表达均显著低于对照组对照组在 4 天时在漏斗部和大部（图 3A）。QXL组在第4天和第8天在大区和第4天在峡部和子宫中IL-1β的表达明显高于对照组（图 3 ）乙）。在第 4 天和第 8 天，QXL 组在漏斗部和峡部中 IFN-γ 的表达明显高于对照组，第 8 天在子宫中也是如此（图 3C）。在第 8 天，QXL 组的漏斗部和子宫中的 IL-2 表达显著高于对照组，第 4 天和第 8 天在枕大部和峡部的 IL-2 表达显著高于对照组（图 3D）。
QX和Mass型IBV在输卵管不同节段对促炎细胞因子基因mRNA表达的影响。A IL-6、B IL-1β、C IFN-γ 和D IL-2。值显示为表达倍数变化的平均值 ± SEM (n = 3)。* P ?< 0.05, ** P ?< 0.01, *** P ?< 0.001, **** P ?< 0.0001 表示感染组与对照组之间存在显著差异。DPI，感染后天数；SEM，平均值的标准误差随后在感染后 4 天和 8 天检测到细胞毒性分子（颗粒酶和穿孔素）和 IFN-α。QXL 组的 IFN-α 表达在第 8 天的漏斗部和第 4 天的大区中显著高于对照组（图 4A）。QXL 组在第 8 天漏斗部、第 4 天在枕大部和第 4 天和第 8 天在子宫中的颗粒酶表达显著高于对照组（图 4 B）。在第 4 天和第 8 天时，QXL 组在大区和第 8 天子宫中穿孔素的表达明显高于对照组（图 4 ）。C）。此外，在第 4 天和第 8 天，与对照组相比，QXL 和 M41 组峡部颗粒酶和穿孔素的表达显著降低（图 4 B、C）。
QX和Mass-type IBV在输卵管不同节段对IFN-α（A）、颗粒酶（B）和穿孔素（C）mRNA表达的影响。值显示为表达式中倍数变化的平均值 ± SEM (n = 3)。* P ?< 0.05, ** P ?< 0.01, *** P ?< 0.001 表示感染组与对照组之间存在显著差异。DPI，感染后天数；SEM，平均值的标准误差蛋壳形成相关基因表达的变化
为了评估参与蛋壳形成的基因的表达，分别在峡部和子宫中检测到 I 型胶原蛋白和 CaBP-D28K。在峡部，感染后8天，QXL组I型胶原蛋白的表达明显低于对照组（图 5A）。QXL组子宫内CaBP-D28K的表达在第4天和第8天明显低于对照组（图5B ）。
讨论
目前，QX是亚洲、欧洲和世界其他地区禽群中IBV的主要基因型，给家禽业造成了巨大的经济损失。一些报告已经说明了不同 QX 型分离株在幼鸡特定器官中的致病性 。然而，产蛋期病毒感染后输卵管的改变仍然未知。在本研究中，我们率先分析了 QX 型 IBV 对各层输卵管不同节段的病理影响，并将其与质量型参考菌株 M41 进行了比较。
与宿主细胞结合是病毒复制周期中的第一个关键步骤 。先前的一项研究证实，QX 菌株可以在体外感染小母鸡输卵管的上皮细胞 。在这项研究中，我们发现QXL和M41菌株都可以感染各层输卵管的上皮细胞；然而，QXL 菌株也大规模感染了管状腺体。该结果表明，QXL 菌株可以很容易地从粘膜上皮释放到固有层，可能是通过由 QXL 菌株而不是 M41 菌株介导的未知机制。以前的报告表明，QX 型 IBV 在幼鸡的输卵管中引起特征性扩张和血清样液体积聚，尽管在该器官中几乎没有观察到变化 。在本研究中，QXL 菌株对各层输卵管的不同节段造成严重损伤，包括漏斗部和枕骨大部管状腺体的扩张，漏斗部和峡部的炎性细胞浸润，以及固有层间质扩张。子宫。这种差异可能是由于鸟类的不同年龄或实验条件造成的。在M41组中，仅在峡部和子宫中观察到上皮细胞的脱屑。这一结果与先前的一项研究一致，该研究表明肿块型 IBV 会导致输卵管器官培养中的上皮细胞变性和脱屑 。
通常，宿主通过由干扰素 (IFN) 介导的经典炎症反应和抗病毒免疫反应来防御细胞内病毒。IFN-γ 是 Th1 控制反应的关键细胞因子，对控制细胞内病原体至关重要 。IFN-γ 还可以在炎症反应中与促炎细胞因子如 IL-1β 和 IL-6 协同作用。先前的数据表明，感染减毒 IBV 会上调促炎细胞因子的表达，包括 IL-1β、IL-6 和 IFN-γ 。目前的结果表明，在 QXL 组中 ，IL-1β、IL-2 和 IL-6 的表达比正常值增加了大约 2-30 倍，而 IFN-γ 表现出更强的增加，在某些情况下更多比正常水平高出 500 倍。
本研究在QXL组输卵管漏斗部观察到巨噬细胞，其中IFN-γ的表达增加近500倍。I 型干扰素是对病原体的先天免疫反应的标志，可直接或间接作用于自然杀伤 (NK) 细胞、CD8 +细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL)、树突状细胞 (DC) 和 B 细胞以调节适应性免疫反应[ 32]。目前的结果表明，在QXL组中，IFN-α在漏斗部和枕骨大部的表达升高。此外，我们还观察到除峡部外，QXL组输卵管中颗粒酶和穿孔素的水平显著增加。这些数据表明 ，QXL 菌株诱导由 Th1 细胞驱动的细胞介导的炎症反应，随后募集巨噬细胞、NK 细胞和其他先天免疫细胞分泌 I 型 IFN 和细胞毒性分子以抑制病毒。过度的免疫反应也会导致输卵管病变。然而，在 QXL 组的峡部，既没有检测到 IFN-α，也没有检测到细胞毒性分子，IHC 结果显示病毒抗原在峡部分布最广泛。这些结果表明，峡部比输卵管的其他部分更容易受到 QXL 应变的影响。在 M41 菌株中，促炎细胞因子和抗病毒分子的表达没有显著改变。因此，我们推测诱导先天免疫反应的能力可能与病毒致病性有关。这与之前的研究一致。
感染 IBV 会影响鸡蛋的质量，例如软壳蛋和沙壳蛋。因此，我们评估了参与蛋壳和蛋壳膜形成的基因的表达。I 型胶原蛋白在峡部表达，蛋壳膜在卵子通过输卵管的过程中形成 。以前的研究表明，纤维成分是由峡部的管状腺体分泌的 。目前的结果表明，在QXL组攻击后8天，峡部I型胶原蛋白的表达下调。通常，在蛋壳钙化过程中，子宫内 CaBP-D28k 的 mRNA 水平会增加 。钙沉积不足是蛋壳形成过程中导致蛋壳质量变差的重要原因。
我们的结果表明，在病毒攻击后 4 天和 8 天，QXL 组中 CaBP-D28k 的表达明显低于对照组。峡部和子宫中 I 型胶原蛋白和 CaBP-D28K 合成的下降可能与免疫相关分子的升高有关。因此，QXL菌株可能通过抑制I型胶原蛋白和CaBP-D28k的合成来影响壳膜和蛋壳的形成。这些结果也支持 Nii 等人的研究结果。，谁表明减毒 IBV 可以降低 I 型胶原蛋白和 CaBP-D28k 的表达。
结论
本研究的发现可能有助于提高对鸡产蛋期 QX 型 IBV 致病性的认识，并制定干预这种感染的策略。但本研究主要是对该现象的描述，QX型IBV向输卵管的发病机制尚需进一步研究。总体而言，我们的研究结果强调了 QX 型 IBV 对产蛋期输卵管不同部位的高致病性，其主要表现为固有层的显著病理变化以及参与蛋壳和蛋壳膜形成的基因的无序表达。
致谢本文作者：
Xiaorong Zhang, Kun Yan, Chengcheng Zhang, Mengjiao Guo， Shuqin Chen, Kai Liao, Zongyi Bo, Yongzhong Cao 和 Yantao Wu。
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