非洲猪瘟诊断和防治

现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2022/9/1 7:59:13 关注：662 评论： 我要投稿

  非洲猪瘟的诊断和防治
  张 涛 译 王祎汀 校 李 红 审

  摘  要：非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种病毒性、出血性疾病，对家猪和欧亚野猪的致死率极高。本文介绍了非洲猪瘟诊断的现有技术和障碍，并就防控策略进行了论述，最后介绍了非洲猪瘟疫苗研究存在的难点以及就进一步研究的方向。
  关键词：非洲猪瘟；诊断；防治；疫苗
  非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是一种病毒性、出血性疾病，对家猪和欧亚野猪具有极高的致死率。尽管引发该病的病毒——非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)的宿主范围有限，也不可能会引发人畜共患病，但其对社会、经济的影响非常大，许多利益相关者都被牵涉其中。出于这个原因，一旦猪群暴发该病，发病地的相关行业管理部门应向世界动物卫生组织通报。目前，对非洲猪瘟的控制仍依赖于严格的卫生措施，因为现今既没有获得许可的疫苗，也没有任何有效的治疗方法。
  1  非洲猪瘟的诊断
  1.1 目前的技术水平和障碍
  在实际生产中，当对ASF执行早期预警、及时干预和监测时，采用快速和可靠的诊断方法极为重要。好的检测方法应能够检测ASFV的所有基因型和突变体，具有高灵敏度和特异性，应根据世界动物卫生组织的指南验证，且易于操作，能够快速解释检测结果。另外，应始终以合理的价格提供，能适应于高通量的应用。这种检测需要伴随潜在的能够区分野毒株感染动物和疫苗接种动物(differentiating infected from vaccinated animal，DIVA)。显然，并非所有的特性都能同时满足，为此，应建立诊断工作流程，考虑所用检测方法的优点和缺点。这可能包括使用栏边检测法(pen-side approaches)，也包括替代性或非侵入性的采样策略。后者对诊断野猪群是否感染ASF具有特殊意义。最近研究人员探讨了通过猪的唾液、拭子样本或诱饵来检测病原体，并证明这些方法可用于猪瘟的检测。
  由于需要向世界动物卫生组织通报，相关建议和法律都对实验室诊断进行了规定。诊断方法和准则可在《世界动物卫生组织陆生动物诊断试验和疫苗手册》(OIE，2019)，或欧盟ASF参考实验室官网(https://asf-referencelab.info/asf/en/procedures-diagnosis/sops)上找到。鉴于ASF在一些欧盟成员国，特别是在西班牙和葡萄牙的历史意义，针对非洲猪瘟的诊断指南和法律条文已经相当成熟，欧洲以外的国家可以直接借鉴这些指南和法律条文。
  总的来说，现有针对ASF的可靠的直接和间接诊断方法对家猪和野猪的特定样本都能发挥作用。当检测来自家猪或野猪的高质量样本时，检测的准确性没有差别(它们实际上是同一物种)。这些检测方法包括从猪巨噬细胞分离病毒、(实时)聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA)、免疫印迹和间接免疫染色标记技术。然而，直到最近，这些测试方法中的大部分都是建立在“内部”准则基础上的，只有通过使用实验室间的对比测试才能保证检测结果的可比性。对于资源有限的国家而言，经过充分验证和易于使用的测试系统才有利于推广使用。在这里，定价合理且不需要额外耗材的商用试剂盒是关键。
  目前的情况和以方法论为导向的研究项目已经促使这种情况有所改善，一些ELISA、实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)以及侧流检测(lateral flow assay，LFA)试剂盒已经进入市场。事实上，用于诊断ASF的商用PCR方法和ELISA方法的种类越来越多，制造商分布在全球各地。虽然大多数检测都能正常工作，但并不总是存在可比较的数据。由于德国对该国用于法定动物传染病和须报告动物传染病的任何检测试剂盒都有官方许可程序，因此此类试剂盒有基本的数据，并且可以在德国官方收集的法定动物传染病的检测方法(https://www.fli.de/en/publications/amtliche-methodensammlung/)中总是可以找到最新的清单。到目前为止，德国已经批准了8种商用实时PCR方法，并在地区实验室中用于排除性诊断和监测。所有这些检测方法都已在德国国家参考实验室(national reference laboratory，NRL)用一组确定的实验样本进行了测试，这些样本代表ASFV的不同基因型(主要是ASFV基因Ⅰ型和Ⅱ型)、宿主物种、基质和感染状态。Schlottau已经在德国国家实验室对其中一些商用PCR方法和三种日常使用的自动提取方法进行了更详细的比较。根据制造商提供的使用说明书，在KingFisher提取平台(Thermo Fisher Scientific)上使用NucleoMag? VET(Macherey-Nagel)、MagAttract Virus M48(Qiagen)和MagMAXTM CORE(Thermo Fisher Scientific，workflow C)试剂盒提取核酸。总的来说，所有的试剂盒都是合适的，在下游应用中可以给出可靠的结果。在PCR试剂盒方面，King等对virotype ASFV PCR试剂盒、INgene q PPA试剂盒、RealPCR ASFV DNA和ID GeneTM非洲猪瘟Duplex进行了相互之间的比较同时与世界动物卫生组织推荐的检测法进行比较。所有的试剂盒都能给出可靠的结果，但在使用不能令人信服的样本时有略微的差异。最近，Schoder等发表了用7种市售PCR试剂盒和3种PCR组合试剂盒检测样本中ASFV的比较数据，这些试剂盒分别为：virotype ASFV 2.0 PCR试剂盒，Adiavet ASFV Fast Time，Bio-T kit ASFV，VetMax ASFV 检测试剂盒，RT-PCR ASFV DNA Test，VetAlert ASF PCR检测试剂盒，以及ID GeneTM ASF Duplex。简而言之，研究人员在2018—2019年ASF疫情暴发期间，对比利时收集的300份特征明显的野猪样本进行了敏感性和特异性测试。这项研究证实，所有商用试剂盒和三分之二的Taq聚合酶适用于诊断实验室进行ASFV检测。这与上述经验相符，并证实了商用试剂盒适用于快速和用户友好型诊断。
  对于抗体检测，德国目前有三种商用ELISA方法被批准用于ASF的血清学诊断。这些检测方法使用不同的抗原，因此可以并行使用。除了基于p72蛋白的阻断ELISA，还有一个间接检测方法，使用p72蛋白、p62蛋白和p32蛋白的抗原混合物(ID Screen? ASF间接ELISA)。此外，一种基于p32蛋白的竞争性ELISA最近已被批准。至于国际上的许多检测方法，它们的性能不容易评估。
  差距和进一步研究的方向：
  ○必须改进病毒分离技术，并进一步优化细胞系，以便能够检测和充分复制田间毒株。
  ○应对ASFV幸存者以及持续感染的家猪和野猪的抗体和病毒生长动力学进行更详细的调查研究。
  ○应进一步分析ASFV在环境中的存活时间。
  ○需要统一ASFV的遗传标记，并进一步协商用于协调分析的基因组区域。
  ○为优化疾病控制，应改进无创(non-invasive)采样技术和即时/现场诊断法。
  ○一般来说，应对诊断方法、流程和技术进行进一步的协调、标准化和普及。ASFV诊断的标准操作规程(standard operating procedures，SOP)应作为全球标准来提供。
  在过去几年诊断检测方法已经得到了很大程度的改进，但仍然需要进行协调，制定适应新形势的诊断工作流程以及疾病生物学常识，以助于人们进一步校准检测方法(另见GARA差距分析报告，https://www.ars.usda.gov/GARA/)。
  2  非洲猪瘟的防控
  2.1 控制策略
  大多数生猪产量巨大的国家都会对重大猪病的监测和控制制定一个具有约束力的法律概要。控制措施中不可或缺的部分是及时且可靠的诊断，扑杀感染猪群，划出限制区，限制猪群的流动，追踪可能的接触者。目前尚无可用的预防性疫苗和其他有效的治疗方法，但欧盟和其他国家将会严格禁止使用。法律概要的一个例子是欧盟层面的立法，它是基于20世纪60年代到90年代ASF暴发期间积累的经验，虽然该法律可能不适用于资源有限的国家，但其基本原则可以在全球范围内应用。因此，本文概述了一些总体要点。目前，欧盟理事会第2002/60/EC指令规定了控制ASF的最低共同体措施。有些章节专门介绍了在疫情可疑情况下、疫情确诊情况下、疫情曾暴发过情况下的措施，接触猪群和流行病学调查中的措施，保护区和监测区的建立，清洁和消毒，解除限制和重新组群所采取的措施，并详细说明了特殊情况，如对屠宰场的怀疑。欧盟委员会第2003/422/EC号指令详细说明了控制措施，并就诊断程序、采样方法、检测结果的评估标准、生物安全要求以及实验室检测的原则和应用提供了指南和最低要求。欧盟层面的法律框架经修改，在2021年被新的动物卫生法取代。基本原则保持不变。
  控制措施的实施取决于兽医服务部门的资源和对这些措施的遵守情况。遵守措施的一个关键点是及时和适当的补偿方案。正如在非洲和亚洲所看到的情况那样，由于缺乏补偿，病猪会出售给屠宰场和市场，从而造成ASF大规模地暴发。
  对于野猪的传染周期，在制定控制措施时必须考虑当地的情况。目前，人们经常使用捷克共和国控制ASF的案例，因为这是(到目前为止)唯一一个将ASF完全从野猪种群中净化的国家。根据这些成功的案例，控制策略可以包括以下内容：分区确定感染区、周围缓冲区和控制区。这些区域应尽快建立，并应足够大。应搜索病死猪的尸体，并进行无害化处理。奖励发现病死猪尸体的人可以提高控制措施的遵守率和成功率。在感染区，应严格执行禁猎期(strict hunting rest)。如果已经确定并且合适，可以允许诱捕。设置隔离栅栏已被证明能够有效控制ASFV的传播，可以根据当地的情况加以应用。栅栏不能防猪，但可以将病毒传播速度降到最低。在可能的情况下，可以实施禁止进入的措施。该措施可以用来减少周围地区的野猪，但必须针对每个案例单独做出决定。
  一旦ASF进入了比较流行的阶段，应调整划分的区域，如果可行的话，可以讨论扑杀剩余的野猪。但该策略必须考虑适用的动物福利和风险因素。应减少疫区外的野猪数量。比利时当局采取了极为类似的措施，取得了明显的效果(https://www.wallonie.be/fr/peste-porcine-africaine)。
  2.2 差距和进一步研究的方向
  ○事实证明，控制农村和庭院式饲养环境中猪的ASF是非常困难的，应制定和应用适应性强——即在各地区有较高接受度——的策略。
  ○对感染野猪群的控制措施需要进一步优化，必须考虑不同区域的条件。
  ○应分析从捷克共和国和比利时等国家对ASF的成功根除和控制计划中学到的经验，并将其用于今后控制ASF疫情暴发的方案。
  3  免疫预防
  3.1 非洲猪瘟疫苗
  到目前为止，仍然缺乏安全有效的抗ASF疫苗，同时缺乏对ASFV足够敏感且不会在ASFV基因组内进一步进行遗传适应的永久性细胞系，这严重阻碍了大多数候选疫苗的生产。疫苗的开发似乎仍然是可行的，因为暴发急性ASF后康复的猪对密切相关的ASFV毒株的挑战性感染具有免疫力。影响疫苗开发的原因部分是由于感染猪产生的抗体不能真正使病毒失去活力(未能完全中和)。此外，许多对建立良好免疫应答很重要的成分在定位和功能上尚未完全被确定，因此，根据个别成分或通过载体表达的抗原生产疫苗具有挑战性。灭活的病毒制剂没有产生实质性的保护作用，不过接种的猪产生了针对ASFV的抗体。最后，还应指出的是，ASFV能够建立复杂的免疫调节和有效的免疫逃避机制，也就是说，它会产生许多能够影响宿主免疫系统的物质，从而使病毒有效地复制。
  随着ASFV大范围传播，相关研究机构加强了疫苗的研究与开发，并取得了一些非常有希望的结果。ASFV疫苗可能比其表面上的研究进展更接近成品。
  鉴于最近几篇综述总结了设计安全高效的ASF疫苗的方法，以下将重点介绍ASF疫苗开发的总体情况、最近发表的论文和进展，以及一些被忽视的问题。
  3.2 减毒活疫苗
  减毒活疫苗可以以毒力自然减弱的ASFV毒株或通过敲除毒力因子导致毒力削弱的毒株为疫苗株。有些疫苗制作工艺是对自然产生的毒株进行合理的改进。
  第一批疫苗生产工艺在20世纪60年代就已获得了许可。这些早期活疫苗是基于减毒的ASFV毒株，并于20世纪60年代在葡萄牙和西班牙的野外条件下使用了数千次。不幸的是，许多免疫猪在接种疫苗几个月后出现了机体功能衰弱和慢性病变，并导致两个国家的发病猪增加。最后，疫苗回收，停止了现场使用。这一经验解释了为什么今天需要对ASFV疫苗候选株的安全性进行非常仔细的检查。ASFV疫苗设计不应仓促解决。
  从20世纪70年代到90年代，俄罗斯进行了通过合理选择减毒株开发紧急疫苗(接种屠宰场和安全处理厂的待宰猪)的研究。根据红细胞吸附抑制(haemadsorption inhibition)和免疫生物学试验确定的特性和血清免疫类型，对ASFV的几种毒株进行了测试和分类。总之，大多数候选毒株仍会诱发接种猪出现相当长的病毒血症和轻微的发热反应。即使在较长的时间之后，疫苗也会产生较高的保护作用，但免疫作用并不完全，特别是当接种猪的免疫力较低时。
  另外，ASFV自然发生的减毒毒株的变异株也被作为候选疫苗株进行了测试。最近，Zani和Gallardo等在波罗的海分离到了这种毒株。在Gallardo等报告初步试验结果后，Barasona等测试了野猪口服接种ASFV Lv17/WB/Rie1株(在西班牙获得专利，专利号为PCT/2018/000069)后的安全性和免疫效果。该毒株为截短的CD2v蛋白(EP402R基因)，不具有红细胞吸附(non-haemadsorbing)性。在对野猪进行免疫-攻毒试验的测试环境中，可以观察到，大多数接种疫苗的野猪和一头早期感染ASFV疫苗株的对照组野猪的体温略有升高，这是唯一观察到的临床症状。用qPCR方法检测，发现部分野猪体内含的ASFV载量很低。在疫苗接种期，大多数接种疫苗的野猪和所有早期接触的对照组野猪都产生了抗ASFV的抗体，证明ASFV疫苗株具有免疫原性和传播性。用野毒株攻毒后，在12头接种疫苗的野猪中，11头猪对致命的攻毒产生了免疫保护(92％)，发生急性ASF的野猪是免疫后没有产生抗体或接种疫苗后体温升高的猪。总之，该结果令人感到前景光明，但仍然缺乏关于疫苗的保护作用、安全性和无害性的更精确数据。Gallardo等在早期对同一毒株进行的研究中发现，至少有一头猪发生了关节肿胀和病变，这表明可能发生了慢性病。此外，疫苗毒株的传播可能会对受影响地区的人群和所在国家产生有利或不利的影响。这种毒株的优势在于它的非转基因特性。
  最有希望成为ASFV疫苗株的候选者是通过同源重组产生的基因缺失突变体。Bosch-Camós等利用这种方法，已经对ASFV的几种毒株合理地敲除了毒力基因和干扰素抑制因子(interferon inhibitors)。敲除的毒力相关基因包括9GL(B119L)、UK(DP96R)、CD2v(EP402R)、DP148R，以及多基因家族(multigene families，MGF)的不同成员。沿着这些思路，敲除不同的I型干扰素抑制因子会产生毒力减弱的ASFV毒株，且对攻毒产生保护作用。从ASFV BA71毒株(基因I型)中敲除CD2v基因的情况也是如此。然而，在ASFV基因Ⅷ型毒株上，同样的敲除并没有产生同等程度的毒力减弱。另一个常见的靶基因是B119L(9GL)。几种主要的毒株显示出毒力衰减和保护作用，但ASFV基因Ⅱ型格鲁吉亚(Georgia)分离株存在问题。对于ASFV格鲁吉亚分离株，通过额外敲除DP96R(UK)基因 实现了毒力完全减毒。然而，一个重要的教训是，ASFV的遗传背景会影响基因缺失突变体的表型。
  Reis等再次证明，合理的基因缺失并不总会产生想要的效果。为了提高ASFV OURT88/3株的安全性，相关研究人员敲除了I329L基因——一个以前被证明可以抑制宿主先天性免疫反应的基因，并在体外对ASFV OURT88/3ΔI329L株进行了测试，以评估I型干扰素(interferon，IFN)的复制和表达情况，同时还进行了猪体内免疫和攻毒试验。虽然ASFV OURT88/3ΔI329L株保持着原有的复制特性，但IFN-β和IFN-α的表达量增加。出乎意料的是，对用ASFV强毒株URT88/1株攻毒后产生的保护作用急剧下降。有趣的是，仅仅敲除I329L基因无法减弱ASFV格鲁吉亚/2007株的毒力。
  最近，Chen等提出了一种缺失7个基因的ASFV减毒活疫苗候选株。该候选株被命名为ASFV HLJ/18-7GD株，基于中国ASFV强毒株HLJ/18株，敲除了编码MGF505-1R蛋白、MGF505-2R蛋白、MGF505-3R蛋白、MGF360-12L蛋白、MGF360-13L蛋白、MGF360-14L蛋白和CD2v(EP402R)蛋白的基因。据报道，这种疫苗候选株的毒力在猪体内完全减弱，并能对毒力强的ASFV HLJ/18株的攻毒(肌内注射和口服)提供剂量依赖性免疫保护作用。更详细地说，所有用低剂量(103 TCID50) ASFV HLJ/18-7GD株免疫的猪(n=4)，在攻毒后出现3～9 d的发热症状；而高剂量(n=4，105 TCID50)组只有1头猪发烧1 d，所有猪均在21 d的观察期中存活下来。给6头猪肌内注射107 TCID50，连续传代后，没有产生阳性样本，盲传代也没有出现传播。接种107.7 TCID50，并依次扑杀后，仅在一些猪的淋巴结中检测到ASFV的DNA。此外，候选疫苗株对妊娠母猪安全。免疫力的持续时间呈高度剂量依赖性。虽然高剂量能够提供长期的保护，但在最后一次接种80 d后，中等剂量的双倍疫苗接种已经不能提供完全的保护。缺乏长期保护的观察结果与Sánchez-Cordón等获得的研究结果相一致。在后一项研究中，Sánchez-Cordón等用ASFV OURT88/3株或BeninΔMFG株给猪进行单次肌内注射免疫后，没有观察到长期保护作用。免疫接种后130 d进行攻毒，所有猪发生急性ASF。免疫保护的持续时间仍然是ASF疫苗的一个弱点。因此，这方面需要开展深入研究和阐明。
  最近，Borca等推出了另一株候选疫苗株，即ASFV-G-ΔI177 L株。这个基于ASFV格鲁吉亚株的候选疫苗株只有I177 L基因通过同源重组技术被敲除。在培养中，该ASFV变异株表现出生长速度放慢(动力学和产量)。ORF I177L编码一个由177个氨基酸组成的蛋白质，该蛋白质的功能未知。用纯化的该基因缺失突变体以102～106 TCID50剂量免疫一次猪，达50％血红素吸附量(haemadsorbing doses 50％，HAD50)，在28 d的观察期里，接种猪临床健康，虽然在整个观察期检测到了低至中等水平的病毒DNA载量，但没有向哨兵猪排毒，并且在试验结束时检测到高水平的抗体。在免疫后28 d的肌内注射攻毒中，所有接种猪在临床上都保持健康。用定制的PCR方法检测到了疫苗株，但未检测到攻毒的毒株。只有低剂量组的一头猪被检测到低水平的攻毒毒株。正如Carlson等所述，通过间接全病毒ELISA方法检测到的ASFV抗体水平与上述保护作用相关。
  3.3 载体疫苗、DNA疫苗和亚单位疫苗
  与减毒活疫苗相比，载体疫苗和亚单位疫苗具有更高的安全性，并可以区分野毒感染动物和疫苗接种动物。此外，疫苗生产通常不会依赖原代细胞。然而，由于缺乏有关保护性抗原及其潜在相互作用的知识，疫苗株的开发受到了严重的影响。此外，亚单位疫苗不能用于野猪的口服接种(这需要采用活疫苗的方法)。
  根据康复猪的血清学反应，结构蛋白p30(由CP204L基因编码)、p54(E183L基因)、p72(B646L基因)、pp62(CP530R基因)和CD2v(EP402R基因)已成为合理设计疫苗株的主要靶蛋白，并在攻毒研究中对蛋白质、DNA和病毒载体的ASFV疫苗株进行了测试。此外，不同的疫苗设计也使用了生物信息学预测的抗原。不幸的是，使用类似抗原的结果并不总是结论性的。这种不一致性可归因于多种因素，包括疫苗的类型、接种策略、抗原和诱导的免疫反应，以及攻毒模型，包括动物遗传学、病毒毒株、疫苗接种和野毒攻毒的剂量等因素。大多数方法都没有产生保护作用或部分保护作用。
  例如，杆状病毒表达p30蛋白、p54蛋白、p72蛋白和p22蛋白诱导动物机体产生具有中和能力的抗体，但对6头免疫猪在第4次加强接种后用ASFV Pretoriuskop/96/4株(ASFV Pr4株)(攻毒剂量为104 TCID50，肌内注射)进行同源攻毒后并没有起到有效的预防作用。攻毒猪发病和出现病毒血症的时间稍稍延后。相比之下，重组杆状病毒在昆虫的体细胞和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)幼虫中表达的p30蛋白和p54蛋白形成的融合蛋白确实诱发了部分保护作用，并减弱了2头猪的病毒血症的严重程度，这2头猪接种了5次疫苗，肌内注射了500 TCID50 的ASFV E75株。猪接种重组的CD2v蛋白后出现了抗体反应，并产生了剂量依赖性保护作用，在用400 TCID50 的ASFV E75株攻毒后，3头猪产生了保护作用。高免疫剂量可以防止猪出现严重的临床症状和可检测水平的病毒血症。
  用p54蛋白、p30蛋白和CD2v蛋白胞外结构域融合的DNA疫苗不会产生保护作用，除非与泛素融合。这种构建体可保护一部分免疫过3次的猪(12头猪中有3头)免受ASFV E75(104 HAU50)株的致命攻击。沿着这些思路，对表达文库(expression library)采取了类似的方法，60％的猪(n=5)2次免疫接种后在受到104 HAU50 ASFV E75株的攻击时得到了部分或几乎完全的保护。尽管有上述结果，但在使用CD2v蛋白、p30蛋白和p54蛋白进行蛋白融合的DNA-初免(DNA-prime)时并没有产生保护作用。在此项研究中，用包括ASFV质粒DNA(CD2v、p72、p32、±p17)和重组蛋白(p15、p35、p54、±p17)的混合物对猪(n=5)进行了3次免疫接种。接种疫苗的猪仍然感染ASFV Arm07株或发病。与未接种疫苗的对照组猪相比，接种疫苗的猪在受到ASFV强毒株的攻击后，出现临床症状、病毒血症和死亡的时间更早。ASFV引发的病理变化在接种疫苗的猪上也更重。
  使用γ干扰素酶联免疫斑点试验(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)对被ASFV免疫猪淋巴细胞识别的病毒蛋白进行合理筛选，得到了由ASFV基因A151R、B646L(p72)、C129R、CP204L(p30)、CP530R(pp62)、E146L、I73R、I125L、L8L、M448R、MGF110-4L和MGF110-5L组成的基因库。这些抗原在复制缺陷型人5型腺病毒(replication-deficient human adenovirus，rAd5)初始免疫和改良的痘苗病毒安卡拉株(modified vaccinia Ankara，MVA)增强免疫的引导下，在挑战ASFV强毒株OUR T88/1分离株后，导致一部分猪的临床症状减轻，病毒血症严重程度下降。
  例如，含有基因B646L(p72)、CP204L(p30)、CP530R(pp62)、E183L(p54)与成熟的p37产物和pp220多聚蛋白的两段成熟p150蛋白(CP2475L基因)相组合的腺病毒载体疫苗，被证明可以诱导猪产生抗体和T细胞反应，包括细胞毒性T淋巴细胞。然而，攻毒感染显示，相对于对照组，一些疫苗(使用9种抗原混合物的佐剂疫苗)有更严重的反应，并且没有产生明显的保护作用。
  最近，对35种合理设计的腺病毒载体介导的ASFV抗原在野猪体内的免疫原性和有效性进行了评估(n=9，按不同的时间表处理)。该混合物包含表达上述抗原的腺病毒和其他      抗原，如EP153R、p10、p15、CP80R、I329L、H108R、K196R、CP312R、F334L、NP419L、NP868R、B66L、H339R和R298L，早先的研究证明这些抗原在家猪体内具有免疫原性。其余的抗原(K145R、B385R、F165R、F778R、S273R、MGF100-1 L、A224L、MGF505-6R和B175L)是根据假定的T细胞表位选择的。挑战是按照“排毒者-猪攻毒-暴露感染”模型进行的，在两个排毒者中肌内接种进行10 HAU50。综上所述，在用ASFV Arm07攻毒时没有观察到保护作用。所有的免疫猪都出现了ASF的临床症状和病理变化。
  Goatley等最近证明，当由复制缺陷型人5型腺病毒(初次免疫)和改良的痘苗病毒安卡拉株(加强免疫)引导时，由8种ASFV抗原组成的抗原库可以在ASFV基因I型分离株攻毒后保护猪免受致命疾病的影响。该实验是早先研究的后续研究，该研究证明不同的抗原具有免疫原性，但在采用DNA疫苗初次免疫(DNA prime)/牛痘疫苗加强免疫(vaccinia boost)的免疫策略——“prime-boost”免疫方案——时没有保护作用。保护性抗原混合物含有B602L基因、B646L(p72)基因、CP204L(p30)基因、E183L(p54)基因、E199L(富半胱氨酸蛋白)基因、EP153R(凝集素样蛋白)基因、F317L基因和MGF505-5R基因的产物。该制剂根本不是有效的疫苗，因为所有接种猪在临床上都出现了症状，并显示出相当严重的病毒血症，但这种方法在抗原选择和证明DIVA兼容的亚单位疫苗可提供保护方面具有应用前景。遗憾的是，以上研究同样不能推断出保护作用的明确相关因素。
  综上所述，针对ASF的病毒载体疫苗是一种可行的方法，然而，抗原的选择是成功的关键，目前仍缺少有说服力的候选疫苗株。
  3.4 疫苗的商业化及其实施
  目前，头条新闻和推特相继报道了潜在的疫苗候选株，它们都是作为成功的案例被推出的，并暗示疫苗在短期内是有效的。然而，由于缺乏有效数据，存在安全性问题，以及消费者担忧，并非所有(或者说，几乎没有)候选疫苗都适合作为一种高度有效的短期工具来控制法定动物传染病，而且对于迄今为止提出的所有改良的候选疫苗株，由于缺乏能够确保病毒在标准化条件下复制和生产的永久性细胞系，疫苗的生产将受到严重影响。所有报道的新的和有希望的候选疫苗株都依赖于原代细胞进行生产，这导致疫苗的生产既不安全也不 可行。
  此外，野猪需要一种基于诱饵的活疫苗。如果这种疫苗株用于野外接种，则需要大量安全性方面的数据。目前为止这方面的研究非常罕见。
  预防ASF的疫苗一旦获得成功开发，它们也只能是控制ASF的一个工具。免疫接种需被纳入ASF控制和预防策略中。在不太理想的条件下，利用疫苗根除疾病的效果很有限，一个例子是经典猪瘟：虽然猪接种猪瘟兔化弱毒活疫苗后能够产生很高的抗体水平，且非常安全，该疫苗可能是预防动物疾病的最佳疫苗之一，但迄今为止，亚洲一些国家仍然无法根除猪瘟。疫苗不能代替生物安全、行为改变、良好的管理、诊断方法和有针对性的扑杀措施。
  3.5 差距和进一步研究的方向
  ◆需要进行ASFV病毒学和功能基因组学研究，用重要的额外数据集(如蛋白质结构和功能)来支撑疫苗的研究开发。
  ◆需要采用统一的攻毒模型，以利用免疫或攻毒试验比较候选疫苗株。
  ◆必须制定与实验性减毒活疫苗有关的安全特征和最低标准，并在这方面达成共识。可能需要一个药典章节。
  ◆应为疫苗生产开发能使ASFV生长或促进ASFV生长但不会导致其基因发生重大改变的基因。
  ◆基因缺失的ASFV变异株是主要的疫苗候选株，应进行更深入的研究和开发。
  4  展望
  未来，非洲猪瘟的防控必须更加注重传统的控制措施，如早期检测、严格的卫生和生物安全措施、扑杀感染猪群、补偿损失、暂停措施、流行病学追踪和野猪控制计划。这是特别必要的，因为短期内可能无法开发出一种可大量生产并可用于野生动物群的合适、安全且有效的疫苗。因此，未来的研究应该集中在填补本综述所列出的空白上。