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猪链球菌病是由多种不同群的链球菌引起的不同临床类型传染病的总称。常见的有败血性链球菌病和淋巴结脓肿两种类型。前者由C群链球菌引起的，发病率和死亡率高，危害大，在断奶后哺育期仔猪的死亡率高达4%~5%，有的甚至高达15%；后者以E群链球菌引起的，临床上最常见而且流行最广。猪链球菌是猪上呼吸道的一种早期定居菌，在5日龄即可定居，多数动物的扁桃体均可携带猪链球菌，且同一头猪可携带不同血清型的链球菌。感染猪虚弱甚至死亡，一旦感染此病就会呈顽固的地方性流行，预防和治疗费用高。为寻求防治猪链球菌病经济有效的方法，笔者进行了抗猪链球菌病高免卵黄抗体的研制。?
1 材料和方法?
1.1 材料?
1.1.1 动物 3月龄健康长沙黄蛋鸡12只，正常笼养。用湖南省畜牧研究所生产的512蛋鸡用全价饲料，自由采食和饮水。?
1.1.2 免疫原 猪链球菌活疫苗（ST171株）由中牧实业股份有限公司江西生物药厂生产。?
1.1.3 其它材料 聚乙二醇6 000（PEG 6 000），上海生化制药厂生产；兔血清由湖南农业大学兽医院小动物室提供；3管“O”型人血清由163医院血站提供。?
1.2 方法?
1.2.1 免疫方法 基础免疫：每只鸡用猪链球菌活疫苗（ST171株），各4头份量（相当于4头猪的用量），分多点皮下注射。加强免疫：基础免疫后10d，每只鸡用猪链球菌活疫苗（ST171株），各8头份量，分多点皮下注射。加强免疫后一周，每只鸡用猪链球菌活疫苗（ST171株），各10头份量，分多点皮下注射。强化免疫：第2次加强免疫后1周，每只鸡用猪链球菌病活疫苗（ST171株），各15头份量，分多点皮下注射。维持免疫：根据抗体效价，在45~60 d按第2次加强免疫的方法和剂量再次进行免疫。?
1.2.2 高免卵黄抗体的制备 收集一定数量的高免蛋（在蛋壳上标明时间），用0.1%新洁尔灭浸泡清洗蛋壳表面的污垢、晾干，无菌分离卵黄。置高速组织匀浆器内搅拌5 min制成匀浆。加青霉素（8 000 u/ml）、 链霉素（10 000 u/ml）、0.01%硫柳汞，充分搅拌均匀后分装于已灭菌的100或500 ml的生理盐水瓶中，加塞、封蜡、贴标签、保存于低温冰箱中。?
1.2.3 高免卵黄液的生物学检验?
1.2.3.1 无菌检验 取成品蛋黄液0.2 ml，分别接种于普通琼脂斜面培养基和厌氧肉汤培养基，37℃培养48 h。?
1.2.3.2 效价检验 用琼脂扩散方法测定。在平皿中倒入15 ml营养琼脂，冷凝后用打孔器打7孔梅型图，孔径和孔距均为3 mm，封底，编号。然后在中央加满抗原， 四周孔加入不同稀释倍数的抗体，加盖，37 ℃作用24 h后观察结果。?
1.2.3.3 性状检验 高免卵黄液是无臭无味、均匀一致的黄色高分子胶体溶液，0℃保存时出现沉淀震荡后沉淀立即消失，不形成凝块。?
1.2.4 高免卵黄抗体的分离纯化 取鸡卵黄液，加4倍体积pH 7?2 0?1mol/l PBS缓冲液和PEG-6 000，使PEG-6 000终浓度达到3.5%，边加边搅拌30 min，离心20 min（4 000 r/min），取上清液加入PEG-6 000，使其终浓度达到12%，边加边搅拌45 min，离心20 min（4 000 r/min），弃上清，沉淀为卵黄抗体（IgY）。将卵黄抗体加生理盐水配制成10%的悬液，4 ℃保存备用。
1.2.5 间接红细胞凝集反应?
1.2.5.1 红细胞醛化试验 取3管人“O”型血液，4 000 r/min，离心3 min。去上清，加pH 7?2 0?1 mol/l PBS 缓冲液冲洗红细胞，将沉积的红细胞充分冲散后，离心3 min（2 000 r/min），反复冲洗5次，然后加pH 7?2 0?1 mol/l PBS 缓冲溶液配制成2.5%悬液，4 ℃过夜。按红细胞1∶〖KG-*2〗10加入10%戊二醛，边加边摇匀，在4 ℃下醛化30~45 min，搅拌后离心6 min （2 000 r/ min），去上清，加 pH 7?2 0?1mol/l PBS 缓冲溶液冲洗3次，再加上述PBS缓冲溶液配制成10%的悬液，镜检两面凹陷，为红细胞完整。?
1.2.5.2 醛化红细胞鞣酸 取3%红细胞悬液，加等量的1∶20 000鞣酸（新制），边加边摇匀，37 ℃水浴15 min， 离心10 min（2 000 r/min）， 用pH 7 2 0?1 mol/l PBS 缓冲溶液冲洗3次， 离心 3 min(2 000 r/min)， 制成10%红细胞悬液，4 ℃保存。?
1.2.5.3 1% 正常兔血清生理盐水的配制 采健康兔耳静脉血于离心管中，于37 ℃水浴箱中感作30 min，离心 25 min（3 000 r/min），取新分离的兔血清，56 ℃灭活30 min，然后取约半量的洗过的压积红细胞，混合均匀后置37 ℃下作用30 min，以除去混合物中可能存在的嗜异性凝聚素，离心 3 min（3 000 r/min），吸取上清1ml，加99 ml生理盐水混合均匀，后置于56 ℃水浴箱中感作30 min，制成1%正常兔血清生理盐水。?
1.2.5.4 鞣酸化红血球致敏 10% IgY生理盐水3.8 ml， 加 1.2 ml 10%醛化鞣酸化细胞和2.8 ml PBS 缓冲液， 混合均匀后置试管中，于37 ℃下感作30 min，离心 30 min，（3 000 r/min），去上清，用10%正常兔血清生理盐水洗3次，每次离心3 min（3 000 r/min），去上清，向沉淀物中加1%正常兔血清生理盐水，制成3%致敏红细胞悬液，4 ℃保存。?
1.2.5.5 对照组用红血球的制作 取3%鞣酸化红细胞4 ml，加1%正 常兔血清生理盐水4 ml，混合均匀后置于37 ℃水浴箱中感作30 min ，后离心3 min（3 000 r/min），去上清，用1%正常兔血清生理盐水洗2次，每次均离心 3 min （3 000 r/min），去上清，向沉淀物中加1%正常兔血清生理盐水，即为3%对照用红细胞液。?
1.2.5.6 1%正常兔血清PBS缓冲液的制作 取0.5 ml正常兔血清，加0.1 mol/l pH 7.2 PBS 缓冲溶液50 ml，56 ℃水浴箱中感作30 min，即为1%正常兔血清 PBS 缓冲溶液。?
1.2.6 血凝抑制试验 用微量吸管吸取1%正常兔血清 PBS 缓冲溶液分别滴加于血清反应盘相邻两列的16个孔中（每行各8个）， 每孔为25μ1， 用另一支微量滴管吸取1ml 生理盐水， 加1ml 1∶〖KG-*2〗50 猪链球菌活疫苗生理盐水（Ag）制成1∶〖KG-*2〗100 抗原（在56℃下灭活30 min），然后分别用两支微量移液器吸取25μ1的抗原各滴入上下两列的第一孔中的稀释液中，进行对倍稀释， 稀释后的抗原由第7孔至第1孔的稀释度分别为： 1∶〖KG-*2〗200， 1∶〖KG-*2〗400， 1∶〖KG-*2〗800， 1∶〖KG-*2〗1600， 1∶〖KG-*2〗3200， 1∶〖KG-*2〗6400， 1∶〖KG-*2〗12800，第8孔中不加抗原，为1%正常兔血清 PBS 缓冲液对照组，用微量滴管吸取猪链球菌抗原致敏的红细胞诊断液向第1列的每孔中滴加25μ1，用微量滴管吸取对照用鞣酸化红细胞液滴加于第2行的每一孔中，每孔25μ1，然后将血凝反应盘置于微型血液振荡器上，振荡3~5 min ，让其充分混合均匀后取下反应盘放入事先铺有湿纱布的搪瓷盘内，置于37℃恒温箱中1~1?5 h，取出观察结果。?
2 结果?
2.1 高免卵黄液的生物学检验?
2.1.1 性状检验 所制得的高免卵黄液无臭无味，呈均匀的黄色胶体状，保存时不形成凝块。?
2.1.2 无菌检验 普通琼脂斜面培养基和厌氧肉汤培养基检验无菌生长。?
2.2 高免卵黄抗体效价的测定?
产蛋鸡猪链球菌病活疫苗（ST 171 株）免疫4次后，不同日期所产蛋的抗体效价，见表1。
表 1 免疫后不同时间所产蛋的卵黄抗体效价?
经4次免疫后鸡体内的抗体水平在第10天达到1∶512，在第15天达到1∶1024，到第13天仍然维持在1∶1024，此期间所产的蛋均具有较高的抗体效价。?
〖JP2〗用琼脂免疫扩散法测定纯化卵黄液的抗体效价，经过72 h 的观察，在1∶128倍稀释抗体的中间有白色的沉淀带出现。〖JP〗?
2.3〖STBZ〗〓血凝抑制试验结果?
血凝抑制效价为1∶1 600。结果见表2 。?
表 2 血凝抑制试验结果
3 讨论?
3.1 产蛋鸡经猪链球菌活疫苗（ST 171 株）免疫4次后，抗体水平滴度在4免后第7天上升到1∶128，第10天抗体效价达到最高1∶1024，直第30天抗体效价仍然维持在这一水平，所以免疫后7~30 d所产的蛋均可以作为高免蛋使用。?
3.2 本试验中血凝抑制效价为1∶1600，说明用 PEG -6 000 置换法从卵黄中提取IgG，不但方法比较简单，而且抗体效价也相当高，是一个提纯卵黄抗体的理想方法。?
3.3 试验结果表明，卵黄抗体是一种有前途的新的免疫球蛋白制剂，从蛋黄中分离纯化抗体是一种高效、廉价、优质的多克隆抗体制备方法，家禽是有效的抗体产生者，在用单一佐剂抗原免疫后，可在长时间内维持抗体的效价。同时，卵黄抗体具有稳定性好，能耐酸和热等优点。Shimlzu 等的研究发现在温度不高于75 ℃和 pH 值在4以上的酸环境中，IgY 能很好地保持其生物活性。因此可将卵黄抗体作为抗菌素和疫苗治疗的辅助剂用于预防和治疗动物的某些传染性疾病，如将卵黄抗体作为饲料添加剂，既可起营养作用，又能起预防和治疗疾病作用，在免疫防治方面具有重要潜能。应用鸡卵黄抗体治疗猪链球菌病不但避免了血清价格昂贵，产量低且易导致过敏反应的缺点，而且具有取材容易，来源丰富，价格便宜，提取方便，无药物残留和耐药性的问题等特点。用选择的抗原重复免疫后，不但鸡血清中抗体含量会增加，相应地卵黄中抗体含量也会增多，现场取病料分离细菌制造自家疫苗，使被免疫产蛋鸡制备高免卵黄抗体将会对本地或本场的猪细菌病的防治起到更好的效果。?
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