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摘要：为检验泰万菌素对猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的防控效果，用2种泰万菌素制品（A、B）和黄芪多糖饲喂妊娠母猪，通过统计临床生产指标、母猪和仔猪抗体水平、病毒检出率以及细胞因子IL-2、IFN-γ表达水平等，综合评价泰万菌素的PRRS防控效果。结果显示：泰万菌素的PRRS防控效果明显优于黄芪多糖，其中泰万菌素A、B组母猪的产健仔率由试验前的84.98%分别提高到94.44%、91.89%，产弱胎、死胎或木乃伊胎率相应降低；泰万菌素A、B组母猪流产率降低，体内抗体下降速率减缓，所产仔猪抗体稳定性和整齐度提高，母猪血液中的PRRS病原检出率和浓度降低，IL-2表达水平下降，IFN-γ表达水平上升。结果表明，泰万菌素可降低妊娠母猪因PRRS造成的繁殖障碍率，同时可通过调控细胞因子水平增强机体免疫力，从而起到防控PRRS的作用。本研究为PRRS防控提供了一种新思路。
猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）感染猪引起的一种高度接触性传染性疾病，因部分感染猪出现耳尖、尾尖、乳头、四肢末端或皮肤发绀，故又称“猪蓝耳病”。PRRS最早于1987年发现于美国，后迅速蔓延至德国、比利时等欧洲国家。1991年荷兰科学家首次分离出该病毒，并将其命名为Lelysted virus毒株，称“欧洲株”；随后美国分离出VR2332毒株，称“美洲株”。1996年，我国首次发现PRRSV。郭宝清等用PAM细胞分离到了CH-1a毒株，杨汉春等利用Marc-145细胞分离到了BJ-4毒株。研究发现，在我国欧洲型和美洲型毒株并存，但以美洲型毒株为主。PRRSV是一种有囊膜的单股正链RNA病毒。猪感染PRRSV后的临床症状主要表现为不同年龄段猪只出现发热、出血、呼吸道症状，以及妊娠母猪流产，产死胎、弱胎为特征的繁殖障碍，严重影响着母猪健康及生产性能。PRRSV可通过干扰正常的抗原递呈和T淋巴细胞活化来抑制机体免疫反应。IFN-γ是重要的先天性细胞因子，可诱导细胞产生多种抗病毒蛋白，诱导MHC分子表达，促进抗病毒免疫，还可抑制微生物在呼吸道上皮附着，是防止病原体入侵机体的第一道防线，而PRRSV感染会引起IFN-γ的表达水平上调。IL-2是一个关键的促炎细胞因子，是免疫应答和炎症反应的基本要素，其表达有助于促进细胞免疫功能和有限的机体免疫应答，而PRRSV感染会促进IL-2等促炎细胞因子的释放。
现阶段，我国的PRRS防控以疫苗接种为主。但PRRS疫苗对异源毒株交叉保护作用不强，导致我国养殖场的PRRS阳性率仍然较高，疫苗免疫效果差和病毒的高变异率给猪场防控PRRS带来了严峻考验。近期研究发现，泰万菌素可起到抗PRRSV的作用，适用于PRRS治疗。泰万菌素系大环内酯类抗生素，可增强非特异性免疫，抑制PRRSV在巨噬细胞中的复制，缩短病毒血症周期，减轻临床症状，加快猪群体内PRRSV抗体的生成并减缓抗体下降，改善猪只体内的IL-2和IFN-γ等细胞因子水平；同时还可通过降低母猪流产率，提高产健康仔猪数，以及改善母猪、仔猪病毒血症等，达到控制病毒垂直传播的目的。为检验泰万菌素对PRRS的防控效果，本研究利用某公司生产的“金太万”制品（泰万菌素20%预混剂，下称泰万菌素A）和另一公司生产的同类产品（泰万菌素20%预混剂，下称泰万菌素B）和黄芪多糖分别拌料饲喂妊娠母猪，通过统计产房生产情况、PRRSV抗体水平、病原检出率以及细胞因子IL-2、IFN-γ表达水平等指标，综合评价泰万菌素的PRRS防控效果，以期为PRRS的有效防控提供新思路。
材料和方法
试验材料
试验动物 在繁母猪300头，品种为加系二元母猪，选自河北省某PRRS阳性养殖场。
主要试剂耗材 PRRSV、猪乙脑病毒（JPEV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）实时荧光RT-PCR检测试剂盒，购自湖南国测生物技术有限公司；PRRSV ELISA抗体检测试剂盒，购自爱德士瑞士生物科技有限公司；RayBio Porcine IL-2 ELISA Kit和RayBio Porcine IFN-gamma ELISA Kit，购自瑞博奥生物有限公司；病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒，购自艾德莱生物有限公司。
试验器材 高速冷冻离心机，型号Neofuge 13R，上海力申科学仪器有限公司产品；超净工作台，型号SW-CJ-1FD，苏州净化设备有限公司产品；酶标仪，型号Multiskan FC，赛默飞世尔科技（中国）有限公司产品。
试验方法
试验猪场选择 对河北省多地猪场进行PRRS调查，统计猪场产房母猪流产率、产健仔数及比例，以及产弱胎、死胎或木乃伊胎数及比例；对疑似PRRS症状猪场内发烧猪只、流产母猪、流产胎儿以及仔猪睾丸去势液，用实时荧光RT-PCR检测试剂盒进行PRRSV、JPEV、CSFV、PPV、PRV检测，综合评定猪场感染情况，以确定合适的试验猪场。
试验分组和用药 在选定的某PRRS阳性场，选择300头母猪随机将其分为3组，即泰万菌素A组、泰万菌素B组和黄芪多糖对照组，每组100头，各组独立饲喂，饲养条件相同。除所用药物种类不同外，用药量相同，均为每吨饲料中添加1 kg，10 d为1个用药周期。
临床指标统计 用药结束后，以10 d为1个阶段，分为1~4共4个阶段（40 d），统计每个阶段的母猪流产率、产健仔率及产弱胎、死胎或木乃伊胎率。
临床样品采集 从每组100头妊娠母猪中随机抽取25头，分别在试验当天以及试验后第15、40天进行前腔静脉采血取样，做好耳号等相关记录；对流产母猪，每窝随机选择1头胎儿进行解剖，取其肺脏等组织进行研磨；对3组母猪所产仔猪在1.2.3中的每个阶段分别随机抽取6头进行采血，并做好周龄和分组等相关记录，然后3 000 r/min离心5 min，分离血清或组织研磨液上清，置-20 ℃保存备用。
流产原因诊断 利用病毒基因组DNA/RNA快速提取试剂盒，对流产胎儿组织提取核酸，用PRRSV、JPEV、CSFV、PPV、PRV实时荧光RT-PCR检测试剂盒检测，对流产胎儿组织进行实时荧光RT-PCR检测，诊断流产原因。
抗体水平检测 利用PRRSV ELISA抗体检测试剂盒，对试验当天及试验后第15、40天采集的母猪血液样品和在4个阶段随机抽取的仔猪血液样品进行PRRSV抗体测定，统计S/P值。
PRRS病原检测 对母猪PRRSV抗体检测结果统计后，对抗体水平偏高的猪只（S/P＞2.0），用PRRSV实时荧光RT-PCR检测试剂盒进行病原检测，对比试验当天及试验后第15、40天采集血液的病毒水平。
细胞因子水平检测 利用RayBio Porcine IL-2 ELISA Kit和RayBio Porcine IFN-gamma ELISA Kit，对试验当天及试验后第15、40天采集的血液样品进行IL-2和IFN-γ水平检测，并统计每次采集血液的检测结果。
结果与分析
试验猪场选择
经调查，河北省某猪场妊娠母猪出现发烧、流产以及产弱胎、木乃伊胎等疑似PRRS症状。对该猪场产房母猪流产率、产健仔数及比例以及产弱胎、死胎或木乃伊胎数及比例统计发现，产房生产的50头母猪中有1头出现流产，流产率为2.00%，产健仔率为84.98%，产弱胎、死胎或木乃伊胎率为15.02%。
对母猪血液、流产胎儿组织和仔猪睾丸去势液，用PRRSV、JPEV、CSFV、PPV、PRV实时荧光RT-PCR检测试剂盒进行PCR检测，结果发现JPEV、CSFV、PPV、PRV均为阴性，只有PRRSV为阳性（图1）。综合考虑在繁母猪数量、饲养环境等因素后，最终选择该猪场进行试验。
临床指标统计
对所有试验母猪停药后，以10 d为1个周期进行为期40 d的妊娠母猪流产率、产健仔率以及产弱胎、死胎或木乃伊胎率统计。结果（表1）显示：在第1阶段，3组母猪的产健仔率与试验前相当；随着试验的进行，泰万菌素A、B组母猪的产健仔率表现出不同程度地升高，产弱胎、死胎或木乃伊胎率相应降低，而黄芪多糖对照组在第2、4阶段分别出现1头母猪流产，耳号分别为170和321，即表现出2.00%的流产率；在第4阶段，泰万菌素A、B组母猪的产健仔率分别达到94.44%、91.89%，产弱胎、死胎或木乃伊胎率分别降低到5.56%、8.11%，而黄芪多糖对照组的产健仔率仍为84.38%。以上结果表明，泰万菌素可明显降低母猪流产率，提高分娩母猪产健仔率，降低产弱胎、死胎或木乃伊胎率，且效果略优于黄芪多糖（P＞0.05）。
流产胎儿病原检测
对黄芪多糖对照组耳号为170和321的母猪流产胎儿组织进行实时荧光RT-PCR检测，结果JPEV、CSFV、PPV、PRV均为阴性，PRRSV为阳性（图2）。
PRRSV抗体检测
母猪 对试验当天及试验后第15、40天采集的血液样品进行PRRSV抗体水平测定。统计结果（图3）显示：随着采血时间的递增，3组猪群PRRSV抗体S/P值均表现出下降趋势，但泰万菌素A、B组猪群S/P值的下降速度明显缓于黄芪多糖组（P＜0.05）。
仔猪 对每个阶段随机抽取的仔猪血液样品进行PRRSV抗体水平测定，统计各阶段采集血液的抗体检测结果。统计结果（图4）显示：随着周龄的递增，3组仔猪PRRSV抗体S/P值均表现出下降趋势，但泰万菌素A、B组所产仔猪的S/P值下降速度明显缓于黄芪多糖对照组（P＜0.05），而A、B组之间的S/P值差异性不显著（P＞0.05），表明泰万菌素可以提高母猪生产仔猪的抗体稳定性；对4个阶段不同周龄的3组仔猪PRRSV抗体S/P值进行标准差（σ）分析，发现泰万菌素A、B组所产仔猪相同日龄的标准差值均远小于黄芪多糖对照组（表2），表明泰万菌素在提高仔猪PRRSV抗体的稳定性和整齐度效果上优于黄芪多糖。
PRRS病原检测
对筛选出的抗体水平偏高猪只（S/P＞2.0）于试验当天及试验后第15、40天采集母猪血液进行PRRS病原检测。结果显示：随着试验的进行，在泰万菌素用药组猪群中，PRRSV抗体水平偏高猪只体内的病毒核酸拷贝数降低，主要表现在Ct值增加，同时泰万菌素A、B组猪群的PRRSV检出率分别降低了75.00%、66.67%，而黄芪多糖对照组猪只体内病毒核酸拷贝数增加，Ct值降低。结果表明，泰万菌素可以抑制母猪体内的PRRSV复制，对PRRS的防控效果优于黄芪多糖。
细胞因子检测
对母猪试验当天及试验后第15、40天采集的血液样品进行IL-2、IFN-γ水平测定。随着采血时间的递增，泰万菌素给药组的IL-2质量浓度在用药开始后呈明显下降趋势，到试验的第40天趋于正常水平，而黄芪多糖对照组IL-2的质量浓度随着试验天数的递增呈缓慢上升趋势（图5-A）；泰万菌素给药组与黄芪多糖对照组猪群试验当天及试验后第15、40天的IL-2质量浓度均差异显著（P＜0.05），而泰万菌素给药组猪群间的IL-2质量浓度差异均不显著（P＞0.05）。泰万菌素给药组IFN-γ质量浓度呈上升趋势，而黄芪多糖对照组IFN-γ质量浓度变化趋于平缓（图5-B）；泰万菌素给药组与黄芪多糖对照组猪群试验当天及试验后第15、40天的IFN-γ质量浓度均差异显著（P＜0.05），而泰万菌素给药组猪群间的IFN-γ质量浓度差异均不显著（P＞0.05）。
讨论
PRRSV至今仍是全球养猪生产中的重要病原体之一，给养猪业造成了巨大经济损失。目前防控PRRS的主要策略是接种疫苗，其中接种最广泛的是灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活疫苗安全性高，但是免疫效果差，而弱毒疫苗免疫效果好，但容易出现毒力返强现象。就目前的PRRS控制现状来看，急需研究高效疫苗和特效药，提高生猪养殖业的经济效益。有研究指出：泰万菌素活性不同于其他抗生素，其脂溶性强，且能进入巨噬细胞次级小体内。偏碱性的泰万菌素可提高次级小体内的pH，改变PRRSV粒子复制需要的pH环境，从而抑制PRRSV复制，并在巨噬细胞胞内溶酶体作用下将PRRSV迅速消化。同时，还可以通过改善猪只体内的IL-2和IFN-γ等细胞因子水平，加速抗体形成，减缓抗体下降，降低母猪流产率，提高产健康仔猪数，以及改善母猪、仔猪病毒血症等手段，控制病毒的垂直传播。因此，在当前日益关注兽药残留、动物源细菌耐药性的社会背景下，泰万菌素能很好满足畜禽养殖场的用药需求。
本研究对妊娠母猪给药泰万菌素和黄芪多糖，然后观察临床生产指标、母猪和仔猪血清抗体水平、PRRS病原检出率和水平以及细胞因子IL-2和IFN-γ的表达水平，综合评价泰万菌素的PRRS防控效果。通过临床生产指标可以看出，猪群给药泰万菌素后在提高母猪产健仔率以及降低产弱胎、死胎或木乃伊胎率方面有着明显改善，而黄芪多糖组则没有明显改变。通过特异性指标PRRSV抗体水平检测可以看出，泰万菌素给药组母猪血清中的PRRSV抗体水平下降速率明显低于黄芪多糖对照组，且泰万菌素给药组与黄芪多糖组在试验当天和试验后第15、40天采集血清的抗体S/P值差异显著，而泰万菌素给药组间差异不显著，表明泰万菌素可以减缓PRRSV抗体水平下降；对仔猪PRRSV抗体水平的检测结果显示，泰万菌素给药组母猪所产仔猪的PRRSV抗体下降速度均缓于黄芪多糖对照组，表明泰万菌素可以稳定仔猪的PRRSV抗体水平；根据标准差所体现的离散度可以看出，泰万菌素可以提高仔猪PRRSV抗体整齐度；对PRRSV血清抗体检测值偏高猪只的病原检测结果显示：泰万菌素给药组在抑制母猪体内PRRSV复制方面起重要作用，使PRRSV检出率大幅度降低；从母猪血清细胞因子检测结果可以看出：泰万菌素给药组诱导的IL-2水平低于黄芪多糖组，表明泰万菌素可以抑制机体可能产生的炎症反应，促进免疫应答。IFN-γ表达水平的上升与下降也与机体的免疫调节相关，对试验初采集的血液进行IFN-γ检测时发现，3组母猪的IFN-γ水平相当，而在用药后，泰万菌素给药组的IFN-γ表达量明显高于黄芪多糖对照组，且试验时间为秋末冬初，正值猪群抵抗力普遍下降之时，这更能体现出泰万菌素可以诱导机体的IFN-γ表达，促进机体产生更快更强的免疫反应，促进抗原递呈。综合以上各种指标来看，泰万菌素的PRRS防控效果优于黄芪多糖。
结论
试验发现，两个厂家的泰万菌素均可降低母猪流产率以及产弱胎、死胎或木乃伊胎率，提高母猪产健仔率，减缓母猪PRRSV抗体下降，稳定仔猪PRRSV抗体水平，提高仔猪PRRSV抗体整齐度以及抑制PRRSV复制，并在一定程度上调节母猪的免疫反应，对PRRS有着明显的防控效果，这为PRRS防治提供了一种新思路。
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