37种中药及其复方对鸡致病性沙门氏菌的体外抑菌试验

现代畜牧网 http://www.cvonet.com 2023/12/11 17:56:23 关注：397 评论： 我要投稿

  作者：王冠男   周子凡   赵 双   寇宇宁   焦梦珍   陈春琴   程晓薇   于 雷

    导读：为研究黄连等37种中药对鸡致病性沙门氏菌的体外抑菌效果，使用水提法制备37种中药的提取液，使其浓度为1 g/mL，通过平板打孔法测定37种中药的体外抑菌圈直径，采用二倍稀释法测定有抑菌效果的中药的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），将抑菌效果较好的中药制备成双联复方中药，测定复方中药对沙门氏菌的MIC和MBC，并用棋盘稀释法测定双联复方中药在体外的联合抑菌指数（FICI）。结果显示：石榴皮、玫瑰茄、五味子的抑菌效果最好，五味子、玫瑰茄的MIC为31.25 mg/mL，MBC为43.75 mg/mL，石榴皮的MIC为250 mg/mL，MBC为350 mg/mL，鸡致病性沙门氏菌对其他药物存在不同程度的敏感性；复方中玫瑰茄+五味子的抑菌效果最好，玫瑰茄+石榴皮、石榴皮+五味子的抑菌效果与单方效果基本一致，抑菌圈直径范围为12.73~18.93 mm，联合抑菌作用效应为无关作用。研究表明单方中药石榴皮、玫瑰茄、五味子和三组复方中药都对鸡致病性沙门氏菌有较强的体外抑菌和杀菌作用，说明用对沙门氏菌抑菌效果较好的单味中药组成复方中药后，其抑菌效果未必会增强。全文已在《饲料工业》2023年第15期刊出。
  鸡沙门氏菌病是由一种或者多种致病性的沙门氏菌侵染机体所引发的一种急性或慢性临床传染性疾病，造成病鸡水样腹泻，严重时可脱水致死[1]。鸡沙门氏菌病在世界各地的家禽养殖领域广泛发生[2]，发病率极高、传染性极强[3]，既可经纵向传播，也可横向感染传播。因其传播方式多样，使其成为该病的防控难点[4]。鸡沙门氏菌病可感染各个阶段的鸡，尤其是1~3周龄的雏鸡，造成发育不全，鸡体内可一直携带病菌，造成新一轮感染，使其生产性能和产蛋性能下降[5]，给我国养鸡行业造成巨大的经济损失。在鸡致病性沙门氏菌病的防治方面，接种疫苗、使用抗生素是对抗沙门氏菌的常见办法，但抗生素的不合理、不规范使用甚至滥用，使该菌对抗生素类药物的耐药性增加，出现多重耐药菌株[6]，导致临床上对鸡沙门氏菌病的治疗情况愈加复杂。欧盟严禁在饲料内添加抗生素，并对家禽以治疗为目的而使用的抗生素进行兽医监督，避免抗生素在体内累积。中国在近年来也开始规范抗生素使用，推行“饲料禁抗、养殖减抗”政策，各地都树立了非抗生素养殖的理念。目前，益生菌、噬菌体、中药等因不易产生耐药性、安全性高、副作用小和抗菌谱广等优势成为热门的替抗物[7-8]。已有研究证实益生菌可有效阻止鸡沙门氏菌的自然感染[4]；多次在鸡的饮用水中投入噬菌体混合物，可有效杀灭鸡泄殖腔拭子中的沙门氏菌[9]。但益生菌不能单独使用，会受到所使用的产品种类（如食品添加剂、产品基质等）的影响，导致微生物的转移[10]。而噬菌体对靶细胞特异性很强，必须确认病原菌后使用，限制了在临床的大规模应用，还要避免使用携带抗生素抗性基因、毒性基因的噬菌体，以免导致细菌宿主的毒力增加[11]。
  相比于益生菌、噬菌体等替抗物，中药具有副作用小、药效持久、不易产生耐药性、残留少等优点，成为替抗中的研究热点。研究发现，饲料中添加中药可增加细菌对抗生素的敏感性，而在饲料中添加益生菌则没有这种作用；并且饲料中添加中药可以调节家禽肠道菌群，促进生长；还可以调整机体免疫系统，提高动物机体免疫力, 减少沙门菌的感染[12-14]。
  为筛选具备替抗潜力的中药，本研究通过二倍稀释法测定玫瑰茄、五味子和石榴皮等37种中药及其复方对鸡致病性沙门氏菌的体外抑菌效果及其MBC和MIC，旨在为进一步研发防治鸡致病性沙门氏菌病的中药制剂提供参考依据。
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  材料与方法
  1.1 材料
  1.1.1 试验菌株
  鸡沙门氏菌阳性菌株YN-1，由青岛农业大学海都学院预防兽医学实验室提供。
  1.1.2 主要试剂与仪器
  黄连、薄荷、黄芩、连翘、紫苏、蒲公英、藏红花、玫瑰茄、五味子、大青叶、丁香、板蓝根、石榴皮、沙参、夏枯草、胖大海、黄柏、玫瑰、桃仁、王不留行、菊花、神曲、苍柏、金银花、大黄、独活、苍术、山药、女贞子、石膏、芦根、通草、决明子、花椒、薏苡仁、桂枝、干姜，皆购于莱阳市枣行药店。
  LB肉汤液体培养基（LB Broth）、LB营养琼脂固体培养基（LB Nutrient Agar），均购于青岛海博生物技术有限公司；GNP-9160隔水式培养箱，购于上海精宏试验设备有限公司；新陶养生煲，购于浙江苏泊尔股份有限公司；TG16-WS台式高速离心机，购于湖南湘仪试验室仪器开发有限公司；0~300 mm游标卡尺，购于上海靓卡量具有限公司。
  1.2 方法
  1.2.1 中药药液的制备
  37种中药各称取20 g，加入200 mL纯化水，浸泡30 min，加热煮沸，开文火煮至100 mL，过滤药渣后，加热浓缩至20 mL，使单味中药药液浓度在1 g/mL。40 ℃下3 000 r/min离心40 min，取上清液，备用。
  1.2.2 细菌悬液的制备
  沙门氏菌YN-1活化于LB营养琼脂平板上，37 ℃培养24 h，挑取平板上部分菌落接种到新的培养基上，重复此步骤2~3次后，挑取长势较好的单菌落，接种于LB肉汤液体培养基中，在恒温摇床中37 ℃、150 r/min培养24 h，调节菌液浓度为1.6×108 CFU/mL，备用。
  1.2.3 抑菌圈的测定
  采用平板打孔法[15]测定单方及复方中药抑菌圈大小，取浓度为1.6×108 CFU/mL的沙门氏菌菌液涂布于LB营养琼脂平板上，用孔径为4.0 mm的无菌打孔器在每个培养皿内打3孔，每个试验孔内加入50 μL中药药液，保持加满不溢出的状态，每种中药药液做三个重复试验。将培养皿正放入隔水式培养箱内，37 ℃培养24 h后，测量抑菌圈直径大小，取平均值。
  抑菌圈判定标准[16]：无抑菌圈则不敏感（-）；抑菌圈直径<10 mm，低度敏感（+）；抑菌圈直径10~15 mm，中度敏感（++）；抑菌圈直径>15~20 mm，高度敏感（+++）；抑菌圈直径>20 mm，极度敏感（++++）。
  1.2.4 单方中药MIC和MBC的测定
  采用二倍稀释法[17]测定中药的MIC。准备12支35 mL的无菌试管，编号依次为1~12，在每支试管中加入5 mL的LB肉汤液体培养基，在第1支试管中加入5 mL单方中药的上清液，混匀后吸取1号试管中的液体5 mL加入2号试管，重复上述操作到第10号试管，吸出5 mL弃掉。随后在1~11号试管中加10 μL菌悬液，第11号试管为阳性对照，第12号试管为空白对照，设置三组重复试验。37 ℃、150 r/min培养24 h，观察结果。按照编号排列，最后一个清澈的试管药物浓度即为该单方中药的MIC。
  根据上述MIC的结果，将澄清试管于LB营养琼脂平板中划线，37 ℃培养24 h后观察结果，找出没有菌落生长的中药最低浓度和有菌落生长的最高浓度，在这个区间内继续稀释：第一个试管中加入900 μL区间中最低浓度药液和100 μL的LB肉汤液体培养基，第二个试管中加入800 μL的药液和200 μL的LB肉汤液体培养基，依此类推，最后一个试管中加入600 μL的药液和400 μL的LB肉汤液体培养基，每个试管中加入10 μL的菌液，37 ℃、150 r/min培养24 h后，划线并设置三组重复试验，观察结果。最后一个无菌生长的培养基的中药浓度即为MBC。
  1.2.5 复方中药的MIC和MBC测定
  根据单方中药药液对沙门氏菌的药敏试验结果，选取其中对沙门氏菌有抑菌效果的中药进行双联复方试验，通过参考文献[16]，按照1∶1的比例进行组合，并测定复方中药对沙门氏菌的联合抑菌指数（FICI），每组设置三组重复试验取平均值。复方中药FICI参考文献[18]：当FICI≥2.0时为颉颃作用；当1.0

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  结果与分析
  2.1 37种单方中药对沙门氏菌的体外抑菌效果
  37种单方中药中有12种对沙门氏菌有抑制效果，其中对石榴皮、玫瑰茄、五味子高度敏感；对黄芩、夏枯草、板蓝根、黄连中度敏感；对丁香、连翘、菊花、桂枝、大青叶低度敏感（见表1）。对苍术、女贞子、桃仁、芦根、通草等25种中药不敏感。
  2.2 中药复方对沙门氏菌的体外抑菌效果
  在复方中药药液中，沙门氏菌对玫瑰茄+石榴皮表现为高度敏感，抑菌圈直径为（15.90±0.50） mm；对玫瑰茄+五味子表现为高度敏感，抑菌圈直径为（18.40±0.53） mm；对石榴皮+五味子表现为中度敏感，抑菌圈直径为（13.90±1.17） mm（见表2）。由于单方中药中有抑菌效果的其他中药双联抑菌圈直径均小于10 mm，均为低度敏感，在表2中不再列举。

  2.3 单方中药对沙门氏菌的MIC和MBC
  玫瑰茄、五味子的MIC均为31.25 mg/mL，MBC均为43.75 mg/mL，抑菌和杀菌效果均比其他中药强。其次是板蓝根、连翘、夏枯草，MIC均为62.5 mg/mL，MBC为62.5~125 mg/mL不等；再次是黄芩、黄连、丁香；石榴皮、菊花、桂枝、大青叶抑菌和杀菌效果最弱。见表3。

  2.4 3种中药复方对沙门氏菌的MIC和MBC
  由表4可知，不同组合的复方中药对沙门氏菌的体外抑菌效果差异较大。玫瑰茄+石榴皮和石榴皮+五味子的MIC为62.5 mg/mL，联合抑菌指数为1.875，为无关效应，其中玫瑰茄+石榴皮的MBC为112.5 mg/mL，石榴皮+五味子的MBC为100.00 mg/mL；玫瑰茄+五味子的MIC为31.25 mg/mL，联合抑菌指数为1.667，为无关效应，其MBC为50.00 mg/mL。

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  讨论
  鸡致病性沙门氏菌病是家禽养殖业一直以来关注的问题，不仅会引发禽类生产性能及繁殖性能的下降，还会导致禽类死亡带来经济损失以及造成人类疾病的风险。使用抗生素是控制鸡致病性沙门氏菌的常用方法，Nair等[19]研究显示，氟喹诺酮类抗生素通过抑制核酸的转录和复制，抑制鸡沙门氏菌的活性；四环素类通过干扰蛋白质的合成。使鸡沙门氏菌存活所必需的酶不能被合成。但长期使用抗生素，鸡沙门氏菌会产生耐药性，主要通过外排泵把抗菌药物泵出胞外或一些基因编码酶对抗生素进行灭活，使菌体内抗生素浓度降低而产生耐药性[19]。所以使用传统的抗生素治疗鸡沙门氏菌感染，不仅会产生耐药性，使治疗效果降低[20]，还会在动物体内大量残留，影响动物生产及生态环境，并会通过食物链的传递直接造成人体抗生素耐药，威胁人类健康[8]。
  中药具有不易产生耐药性的优点，因此在临床治疗多重耐药菌所致感染方面具有十分广阔的应用前景[21]。杜学林[22]的研究表明，使用中药治疗鸡致病性沙门氏菌比抗生素治疗效果更佳。中西药抑菌机理相近，一类抗生素只有一种抑菌机制，但由于中药具有复杂的成分，同一种中药具有不同的抑菌机制。王芝超等[23]发现，黄连不仅能抑制细菌生物膜的形成，还可以降低主动外排泵基因的表达量。本研究显示，鸡致病性沙门氏菌对玫瑰茄、五味子、石榴皮表现为高度敏感，夏枯草、黄芩、黄连、板蓝根表现为中度敏感，其中玫瑰茄和五味子的抑菌和杀菌效果最强。玫瑰茄的有效抑菌成分为黄酮类化合物，主要是通过与DNA发生嵌入结合和氢键结合，使DNA不能进行正常的复制和转录[24]，达到抑菌效果。除此之外，玫瑰茄中还含有酚类、花青素，挥发油、生物碱等功能性成分，玫瑰茄具有抑菌作用可能是这些物质综合作用的结果。但目前关于玫瑰茄作为中药抑菌的研究还较少，本试验为玫瑰茄在抑菌作用方面提供参考，但对其抑菌机理的研究还需进一步探索。五味子中有效抑菌的主要成分为木脂素类物质，具有广谱抗菌活性，主要通过破坏细菌细胞膜的结构发挥抑菌作用[25]；黄连的抑菌效果是由于多种抑菌物质协同的结果，其抑菌成分与黄连自身极性极大的碱性或酸性化学基团有关[26]；石榴皮具有广谱抑菌特性，其提取物中的多酚类化合物通过抑制沙门氏菌生物膜的形成发挥抑菌作用[27]。在本试验中，中药双联复方的体外抑菌效果与单方中药的抑菌效果基本一致，因双联复方组合的作用效应为无关作用，所以对中药制剂的配伍比例、提取方法、药物的最适用药时间等问题，还需要进一步地研究和探索。由于各种中药自身特性不同、抑菌成分不同，可能会产生不同的抑菌效果。中药有效成分的提取方法、分离的菌株不同也会影响作用效果。
  此外，以往的试验都是以抑菌圈效果较好的中药作为主要的鉴别标准组成复方，而忽略了其他效果不明显的中药的抑菌作用，这些中药之间相互配伍可能会有更好的抑菌效果，这为后续的研究奠定了基础。
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  结论
  本研究37种中药中仅有12种对鸡致病性沙门氏菌有抑菌效果，其中玫瑰茄、石榴皮、五味子的抑菌效果较好；复方中药中玫瑰茄+五味子效果最好，玫瑰茄+石榴皮、石榴皮+五味子的抑菌效果与单方中药抑菌效果相差不大，FICI分析显示为无关作用。本试验结果可为后续制作抑制鸡致病性沙门氏菌的中药制剂提供参考依据。
  参考文献及更多内容详见：
  饲料工业，2023，44（15）：66-70
  引用格式
  王冠男，周子凡，赵双，等. 37种中药及其复方对鸡致病性沙门氏菌的体外抑菌试验[J]. 饲料工业, 2023, 44(15): 66-70.