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PRRS和PCV2共感染对猪场的影响及免疫策略
汪志恒 1，3 #，向金梅 1，4 #，陈文钦 4，杨茂春 2，于福来 2，赖庆光 2，张苗苗 4，万春云 1，2 *
（1.长江大学，湖北荆州434000；2.浙江美保龙生物技术有限公司，浙江金华321000；3.罗牛山畜牧股份有限公司，海南海口 570000；4.湖北生物科技职业学院，湖北武汉430000）
猪圆环病毒2型（PCV2）和猪蓝耳病（PRRS）已经在世界范围内广泛流行，在我国流行趋势更加复杂，即使在养猪很少的区域，也容易看到这两个疾病的存在或共感染的情况，香港地区生猪保有量很低，有学者统计了香港特别行政区（HKSAR）PRRSV和PCV2的流行病学数据，从2020年2月3日至2021年3月11日，对香港特别行政区40个猪场中的29个进行了一项调查，用实时PCR检测了来自7个年龄组（代表关键生产阶段）的猪只。根据所有农场所有猪只的汇总结果，48%、86%和79%的农场证实存在PRRSV欧洲株（PRRSV1）、PRRSV北美株（PRRS2）和PCV2。PRRSV1和PRRSV2在年轻猪只中更为流行，8周龄猪只的患病率最高，分别为32.1%和51.5%。相比之下，PCV2流行率在各年龄组之间的分布似乎更为对称，12周龄至24周龄的猪只报告了较高的流行率，但较年轻的猪只和母猪的流行率较低。这项研究的结果表明，PRRSV1、PRRSV2和PCV2在香港特别行政区的养猪场广泛传播。
养殖密集的地方形势更加不容乐观，我国早在2003年就有PRRS和PCV2混合感染的明确报道，随后多年一直有混合感染的病例报道，并且提高了猪病控制上的难度。有研究对从中国八个省市采集的病死猪样本进行了评估，结果表明PRRSV、猪瘟病毒、PCV2和PCV3的共感染率达到15.72%，另一项关于增殖性和坏死性肺炎（PNP）病变的研究表明，PRRSV和PCV2的共感染更常见于断奶仔猪，共感染率为42%。此外，51.9%的PMWS病例中检测到PRRSV。在发生病变的猪舍中观察到涉及PRRSV和PCV2的高并发感染率，甚至可以假设PRRSV和PCV2的共同感染是PCVAD（圆环病毒相关病）的主要原因之一。
总之，目前在我国PRRS和PCV2共感染已经是一个明确并且没法回避的问题，两个病毒共感染会使病情更复杂，控制也更难，但是究竟共感染之后有哪些复杂性和影响，如何免疫对这种共感染情况更有效等问题，依然尚未明确。笔者总结了近年来能查到的文献，试图对此做出一些回答。
但是，总体来看目前关于两者共感染的研究并不太深入，而且不同的研究结果似乎存在一些差异，这可能与PRRS是单宿主病原体限制了其研究方法和其自身极高的突变率有比较大的关系。目前已经有人统计了共感染试验研究中，不同的PRRSV毒株或感染序列、动物模型和易感细胞等都影响观察结果（表1）。
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PRRS和PCV共感染带来的影响
从目前已知的情况来看，共感染很容易发生，有人对加拿大患有断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）的7个农场进行了分析，以评估PCV2和PRRSV感染的流行率以及PCV2和PRRSV共感染的影响因素。试验结果显示，母猪PCV2阳性感染与仔猪PCV2感染之间存在极显著相关性（P＜0.01）。在PCV2抗体滴度较低的母猪所产的仔猪中，PCV2和PRRSV共感染的风险是中高滴度母猪的1.85倍（P=0.03），而且在猪群密度较高时，共感染风险大大增加。此外，PRRSV和PCV2都针能对宿主的免疫细胞，破坏其免疫功能，导致对主要和次要病原体的易感性增加，这可能影响宿主的生长性能以及相关疾病的发病率和致死率，可以推测共感染会比单独感染给猪场带来更大的影响，但是实际的共感染影响直到2000年后才被关注。
2006年，美国启动了一个诊断项目，用以确定受PCVAD影响的农场中的共同感染因素有哪些，他们首先建立了PCV2 DNA实时聚合酶链反应定量（qPCR）的方法，并以此对美国共23个养猪场的血清进行了PCV2病毒载量检测，分析了这些猪场PRRSV疫苗的接种情况及其可能对该PCV2载量的可能影响。统计分析的结果显示，与未接种PRRS疫苗的动物相比，接种PRRS疫苗导致13周或以上的动物PCV2病毒载量显著降低，但接种猪PRRS疫苗对4～12周龄猪PCV2的qPCR结果没有影响。说明在适当控制PRRS的群体，比没有疫苗控制PRRS的群体，PCV2载量更低，群体更稳定。
PCV2与PRRSV感染途径也被研究，这两种病毒都通过鼻腔进入，鼻咽相关淋巴组织（NALT）充当黏膜免疫系统和第一道屏障。有研究对PCV2和PRRSV共感染的猪只的NALT进行组织学检查。对6头猪只进行尸检，并采集其NALT、扁桃体和肠系膜淋巴结。结果发现，共感染导致NALT中巨噬细胞、淋巴细胞耗竭减少、多核巨细胞、胞浆内包涵体和中性粒细胞浸润增加。原位杂交显示所有猪只的NALT中PCV2信号阳性，一半的猪只NALT中PRRSV阳性信号。PCV2阳性巨噬细胞主要见于滤泡，而PRRSV阳性组织主要见于隐窝周围和上皮正下方。定量PCR显示NALT中有108-1010拷贝的PCV2 DNA/L和102-104拷贝的PRRSV DNA/L。因此两种病毒在NALT和扁桃体中的共感染和复制可能抑制宿主免疫并促进与其他病原体的共同感染。
为比较PCV2不同基因型的毒株和PRRSV-2混合感染，与单独感染PCV2的致病力的差异，研究者用三种基因型PCV2（a、b和d）单独与混合PRRS感染试验猪，发现混合感染和单独感染PCV2在病毒血症水平、肺和淋巴病变严重程度以及淋巴病变中PCV2抗原载量方面都出现明显差异。证实无论PCV2基因型如何，与单独接种PCV2的猪只相比，混合感染PCV2/PRRSV的猪只具有显著更严重的临床症状、更低的平均日增重、更高水平的PCV2病毒血症以及更严重的耳和淋巴病变。从不同PCV2的基因型共感染来看，PCV2d/PRSV2的共感染猪只具有明显更高的PCV2病毒血症水平、更严重的肺部和淋巴病变，组化结果显示淋巴病变内有更多的PCV2阳性细胞，提示PCV2的载量增加更明显，共感染PCV2a/PRSV2和PCV2b/PRRSV2的猪只相比2d基因型的共感染相对轻微，而这三种基因型的PCV2单独感染猪只，在病毒血症和相关淋巴病变之间没有发现差异，这个试验的结果表明，PCV2a/PRSV2、PCV2b/PRRSV2和PCV2d/PRSV2的共感染之间的毒力存在显著差异。另外一项研究也得到了类似的结果，在该试验中比较了4种PCV2基因型（2a、2b、2d和2e）在单独感染这4种PCV2基因型中的1种的猪只和同时感染猪圆环病毒的猪只中的毒力4种PCV2基因型中的1种与PRRSV2的组合。根据血液和淋巴结中PCV2负荷的水平以及淋巴病变的严重程度来确定毒力。在单个感染组中，PCV2a、PCV2b和PCV2d导致彼此相似的毒力，并且都比PCV2e组更具毒力。在双重感染组中，PCV2d和PRRSV的组合比其他3种PCV2基因型（2a、2b和2e）更具毒力，每种基因型都与PRRSV组合。PCV2a+PRSV和PCV2b+PRSV在双感染猪只中的毒力均高于PCV2e+PRSV。与其他3种PCV2基因型（2a、2b和2e）相比，PCV2d的毒力增加可能归因于PCV2d开放阅读框2（ORF2）内发现的额外氨基酸（赖氨酸残基）。相反，与其他3种PCV2基因型（2a、2b和2d）相比，ORF2中的额外氨基酸可能会降低PCV2e的毒力。这个试验结果表明，PCV2d是与PRRSV共感染的猪只中毒力最强的PCV2基因型。结果还表明，PCV2 ORF2的遗传差异可能影响PCV2基因型的毒力。尤其需要注意的是，目前我国田间流行的PCV2目前已经逐步过渡到以PCV2d基因型为主，在这种情况下，和PRRS出现混合感染其症状可能比以往会更加严重，致死率更高。
为了确定两种时间和基因上不同的2型PRRSV分离株在体内感染动力学的差异，同时感染和不感染PCV2a或2b型，62头猪随机分为7组：阴性对照组（n=8）；同时感染PRRSV毒株（VR-2385）和PCV2a（CoI-92-2a；n=9）、同时感染VR-2385和PCV2b（CoI-922b；n=10）、同时感染2006年PRRSV病毒毒株（NC16845b）和PCV2a（CoI-06-2a；n＝9）、同时感染NC16845b和PCV2b（CoI-06-2b；n=1）、感染VR-235（n=9）和感染NC16845（n=9）等组。在接种前和接种后第3、6、9和12 d（dpi）采集血样，并测试PRRSV抗体和核酸、PCV2抗体和核酸、全血计数和干扰素γ（IFN-γ）水平。无论是否并发PCV2感染，VR-2385感染能以较高水平复制，并在dpi 6达到峰值复制水平。与感染NC16845b的猪只相比，感染VR-2385的猪只在dpi 3和dpi 6的血清中的病毒核酸显著更高。NC16845b病毒复制高峰出现在dpi 9和dpi 12之间，并与这些猪只的抗PRRSV抗体反应延迟有关。与单独感染PRRSV的猪只相比，PCV2共感染导致更严重的宏观和微观肺部损伤，并且抗PRRSV IgG反应更强。
Chun Kuen对台湾一家养猪场发生的繁殖障碍事件进行了调查。通过组织病理学、聚合酶链反应和免疫组化的试验，发现PCV2和PRRSV共感染更容易造成繁殖碍。
为观察猪只相继感染PRRS和PCV2这两种病毒的致病性，有试验将猪只分为：HP-PRSV/PCV2（第1组，接种HP-PRSV，一周后接种PCV2）、PCV2/HP-PRSRSV（第2组，接种PCV2，一周之后接种HP-PPRRSV）、HP-PRSV+PCV2（第3组，同时接种HP-PRSV和PCV2），PRRS（第4组，接种PRRS），PCV2（第5组，接种PCV2）和对照组（第6组，未感染），试验持续了28 d。接种后每天记录临床症状和直肠温度，每周记录体重，获取血清样本用于病毒核酸定量和抗体滴定。通过流式细胞术测定CD3+、CD4+、CD8-、CD3+、CD3-和CD8+细胞、自然杀伤（NK）细胞和单核细胞的变化。测定血清中干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子a（TNF-a）、白介素10（IL-10）和巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）的浓度，记录试验感染猪只不同组织的病理变化。结果显示，先感染PRRS再感染PCV2的仔猪病毒载量最高，抗体滴度最低，临床症状最严重，死亡率最高，与其他HP-PRSV感染组相比，该组的间质性肺炎更严重。血清IFN-γ、TNF-α、IL-10和GM-CSF水平在第1组中变化最为广泛（增加或减少），每个免疫细胞亚组也是如此。提示HP-PRSV和PCV2共感染增强了两种病毒在试验仔猪中的复制，并导致更严重的临床症状和病变，而猪只依次感染HP-PRSV和PCV2使这两者具有更大的协同效应。
还有学者研究发现，PCV2a和PCV2b同时感染会增加PRRSV在猪体内连续传代期间的氨基酸突变率，使PRRS变得更复杂难以控制。
有研究者认为共感染病毒时DC（树突状细胞）诱导的Treg（调节性T细胞）数量显著高于单独感染PCV2的DC（P＜0.05），认为共感染时通过调节Treg介导免疫抑制，使共感染比单独感染更加严重可能是机制之一。
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共感染的免疫策略
共感染的复杂性给很多猪场的疾病控制带来难度，总体上免疫是不可缺少的一环，但是如何确定免疫的优先性，免疫后的效果如何，都需要进一步研究。
Changhoon Park等从病毒血症、中和抗体、特异性IFN-γ-SCs，淋巴结和肺部的病变和抗原载量等方面评估使用PRRS和PCV2疫苗对两者共感染的控制效力。结果显示，接种PCV2疫苗减少了共感染猪的PCV2病毒血症、PCV2诱导的病变和PCV2抗原载量。而接种PRRSV疫苗可能增加双感染猪的PCV2病毒血症、PCV2诱导的病变和PCV2抗原。因此，单独使用PRRSV疫苗并不能降低共感染猪中PRRSV引起的PCV2损伤的增强（2013）。这提示在临床上针对这类混合感染时，两种疫苗都要进行免疫，但PCV2疫苗要适当优先于PRRS疫苗，或者实行两者共免疫。
Jiwoon等根据在猪繁殖和呼吸综合征病毒、猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型等3种病原体攻毒模型上进行了这3种疫苗接种策略的研究，试验中猪只在21 d时同时接种猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪肺炎支原体和猪圆环病毒2型（PCV2）疫苗，在42日龄时用PRRSV和猪肺炎支原体攻毒，然后在56日龄时用PCV2攻毒（0 dpc）。在临床表现（平均日增重和临床体征）、微生物学（病毒血症和鼻腔脱落）、免疫学（抗体和干扰素-γ分泌细胞）和病理（病变）结果方面，接种疫苗的攻毒组和未接种疫苗的攻毒组之间观察到显著差异。3个接种疫苗的攻毒组在微生物学（猪肺炎支原体鼻脱落和PCV2病毒血症）和免疫学（猪肺炎链球菌和PCV2特异性干扰素-γ分泌细胞）结果方面存在显著差异。显示PRRSV疫苗、猪肺炎支原体疫苗和PCV2疫苗的接种方案对于控制PRRSV、猪肺炎链球菌和PCV2从断奶到保育结束期间的三重攻毒是有效的（2018）。
但是也有研究发现，猪只单独接种PRRS弱毒活疫苗，而不接种PCV疫苗，在接种后采用PRRSV和PCV2组合同时进行攻毒，结果显示，在攻毒后早期，接种疫苗组中出现PRRSV相关临床症状的猪只数量减少，平均日增重（ADG）增加，证明了PRRS疫苗对PRRS具有保护作用，但是，随着时间的推移，免疫了疫苗的组中，更多的猪只表现出PCV2病毒血症增加、ADG降低、PCVAD临床症状增加和死亡率增加。作者推测，在这种疾病模型中，PRRSV疫苗接种的早期益处被PCVAD的后期扩增所抵消导致这一现象。这个试验侧面显示单独免疫PRRS而不免疫PCV2，随养殖时间的延长其缺陷逐渐显现和突出，并不可取。
需要注意的是，尽管广泛使用PCV2疫苗，能够控制保育阶段的PWMS等问题，但PRDC仍然是一个严重的呼吸道问题，尤其是育肥后期的PRDC问题，控制难度很大，这和PCV2免疫的保护时长可能有一定的关系，在育肥后期PRDC严重的猪场，可以将排出PCV2的免疫改为两次。PRRS的主要影响日龄在8周龄左右，其次是16周左右，两者貌似时间间隔较大，但实际上由于PRRS和PCV2的协作性影响，在已经免疫过PCV2的猪场里，经常也带来保育8周龄左右的PCVAD，并且难于控制。因此这两者进行协同免疫也很重要，也可以尝试进行这两种灭活苗的联合免疫。
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